目的·研究磷酸核糖焦磷酸合成酶1(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1,PRPS1)I72位点突变是否能使急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)细胞对巯嘌呤类化学治疗(化疗)药物 6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)、6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine,6-TG)产生耐药性,并解释其作用机制.方法·将临床上已发现的PRPS1基因的各突变(I72F、R177S、V316L)和2个ALL细胞系(KOPN72bi和RS4;11)中存在的PRPS1基因突变(V208A、V289A)分别插入融合了绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的载体pGV303中,用已证明的对巯嘌呤类化疗药耐药的PRPS1 A190T突变为阳性对照,对该类药不耐药的空载体pGV303(Vector)、PRPS1野生型(wild type,WT)及PRPS1 I72V突变为阴性对照.将上述构建好的载体瞬时转染入HEK-293T细胞(简称293T细胞)中,并采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测PRPS1各突变体在293T细胞中的蛋白表达情况.采用药物敏感性实验检测并计算6-MP或6-TG对上述瞬转PRPS1各突变体的293T细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50).随后,除PRPS1 I72F和I72V之外,将第72位异亮氨酸(isoleucine,I)变成其他氨基酸的多个突变即I72M、I72L、I72N、I72S、I72T分别插入载体pGV303中,瞬时转染入293T细胞后采用Western blotting、药物敏感性实验检测各突变体在293T细胞中的蛋白表达情况以及6-MP或6-TG的IC50.采用慢病毒感染法将PRPS1 WT、I72F、I72V、A190T及载体pGV303感染REH细胞系,通过流式细胞术分选GFP阳性细胞以获得PRPS1各突变体稳定表达的细胞,并采用Western blotting及药物敏感性实验检测各突变体在REH细胞中的蛋白表达情况以及6-MP或6-TG的IC50,用以验证293T细胞获得的药物敏感性实验结果.采用Annexin Ⅴ/DAPI双染法评估各REH细胞系的凋亡情况,并通过Western blotting检测各REH细胞系的DNA损伤相关蛋白[S139位点磷酸化的组蛋白H2AX(phosphorylated H2AX-S139,γ-H2AX)、磷酸化的细胞周期检验点激酶 2(phosphorylated check point kinase 2,pCHK2)]和细胞凋亡相关蛋白聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶剪切体[cleaved poly(ADP-ribose)polymerase,cleaved PARP]的表达水平.使用PDB数据库(Protein Data Bank)中编号为2HCR(PDB code 2HCR)的PRPS1晶体结构图,通过三维成像及PyMOL软件预测并绘制I72位点、I72V和I72F的氨基酸残基及空间构象图.结果·Western blotting结果显示,瞬时转染的外源性PRPS1各突变蛋白在293T细胞中成功表达;药物敏感性实验结果显示,表达PRPS1 I72F、R177S、V316L、V208A与阳性对照A190T的293T细胞对6-MP或6-TG的IC50 均远高于表达V289A及阴性对照Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000).将第72位异亮氨酸变成其他氨基酸后,Western blotting结果显示瞬时转染的外源性PRPS1 I72位点的各突变蛋白在293T细胞中成功表达;药物敏感性实验结果显示,表达PRPS1 I72M、I72F、I72L、I72N、I72S、I72T与A190T的293T细胞对6-MP或6-TG的IC50均远高于表达Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000).慢病毒感染REH细胞后,Western blotting结果显示在已构建的稳定细胞系中PRPS1 WT、A190T、I72F、I72V的蛋白高表达且表达量相似;药物敏感性实验结果显示,表达PRPS1 I72F、A190T的REH细胞对6-MP或6-TG的IC50均远高于表达Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000),与293T细胞中瞬时转染得到的药物敏感性结果一致.Annexin Ⅴ/DAPI双染法、DNA损伤和凋亡相关蛋白的Western blotting检测的结果均显示,经6-MP处理后,表达PRPS1 A190T、I72F的REH细胞系的DNA损伤和凋亡率明显低于表达Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000).蛋白结构分析结果显示,PRPS1 I72F会使PRPS1的空间构象发生改变.结论·PRPS1 I72F、R177S、V316L、V208A、I72M、I72L、I72N、I72S、I72T突变可使细胞获得对巯嘌呤类化疗药的耐药性,PRPS1 V289A、I72V突变不影响细胞对巯嘌呤类化疗药的敏感性.293T中的药物敏感性实验结果和REH中的药物敏感性实验结果一致,证明293T细胞可以作为检测PRPS1突变对巯嘌呤类化疗药物耐药性的快速研究模型.PRPS1 I72位点突变对巯嘌呤类化疗药耐药性的影响可能与PRPS1结构发生改变有关.

目的 研究3,5,2',4'-四羟基查尔酮(P40)对高尿酸血症大鼠尿酸的影响及对PC12细胞嘌呤代谢关键酶的影响.方法 灌胃给予SD大鼠P40 (2.0、4.0和8.0 mg/kg)5次,末次给药前1h腹腔注射氧嗪酸钾(250mg/kg)诱导成高尿酸血症动物模型,注射后2h取血,用磷钨酸法测定血尿酸水平及肝尿酸含量.给予PC12细胞系列浓度的P40和阳性对照药别嘌醇后培养48 h,收集细胞提取总RNA,采用逆转录聚合酶链(RT-PCR)的方法,检测嘌呤代谢关键酶HGPRT、PRPS和PRPPAT mRNA的表达水平.结果 给予P40 2.0、4.0 mg/kg均能显著降低高尿酸血症大鼠的血尿酸水平,和模型组相比,差异有统计学意义(P＜0.01),但对肝尿酸含量没有影响.给予P401×10-8,1×10-7, 1×10-6 mol/L处理PC12细胞48 h后,对HGPRT、PRPS和PRPPAT基因的mRNA表达没有明显影响,与对照组相比差异无统计学意义(P＜0.01).结论 在本实验条件下,P40能降低氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症大鼠的血尿酸水平,对PC12细胞的HGPRT、PRPS和PRPPAT基因的mRNA表达无影响.

目的 探讨磷酸核糖焦磷酸合成酶2 (RRPS2)在生精功能不同的睾丸组织中的表达情况以及可能的生物学机制. 方法 收集2015年7至2017年6月期间在我院病理科存档的石蜡包埋睾丸组织标本63例,其中45例标本来自无精子症或严重少精子症患者,18例组织标本取自生精功能正常者,采用免疫组化法检测生精功能不同的睾丸组织中PRPS2表达情况.采用流式细胞术和MTT方法分析PRPS2基因沉默或过表达对GC1精原细胞、GC2精母细胞和TM4支持细胞凋亡和增殖活性的影响.采用qRT-PCR和Western blot法检测PRPS2对E2F1转录因子表达的影响. 结果 重度生精功能不良的睾丸组织(35.71％)以及唯支持细胞综合征睾丸组织(21.43％)中PRPS2高表达,显著低于生精功能正常的睾丸组织(72.22％)(P＜0.05);GC1细胞株中PRPS2表达量显著高于GC2和TM4细胞株(P＜0.05);shPRPS2基因沉默后,GC1细胞、GC2细胞和TM4细胞凋亡率较空白对照组显著增加,而增殖活性显著降低(P＜0.05).PRPS2基因表达上调后,细胞凋亡率较空白对照组和shPRPS2细胞组显著降低,增殖活性显著升高(P＜0.05);shPRPS2基因沉默后,E2F1 mRNA和蛋白表达量较空白对照组显著降低(P＜0.05).而PRPS2基因表达上调后,E2F1 mRNA和蛋白表达量较空白对照组和shPRPS2细胞组显著上调(P＜0.05). 结论 PRPS2参与生精细胞凋亡和增殖过程,其可能的作用机制与下调E2F1转录因子的表达有关.

目的 探讨人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子介导的磷酸核糖焦磷酸合成酶2(PRPS2)表达下调对胶质瘤U251细胞生长增殖、细胞活力以及细胞周期和凋亡的影响.方法 构建pGGN-hTERT-PRPS2干扰载体及阴性对照载体,转染U251细胞后;采用RT-PCR检测空白对照组、阴性对照组及实验组中PRPS2基因表达情况;采用Cell Counting Kit8细胞增殖试剂盒(CCK-8)检测细胞活力;采用Hoechst 33342染色检测细胞凋亡与坏死情况;进一步通过流式细胞术检测PRPS2对细胞周期和凋亡的影响.结果 阴性对照组(转染阴性对照载体)与空白对照组相比,U251细胞中PRPS2基因表达及各项生物学特性均差异无统计学意义(P＞0.05);实验组(转染pGGN-hTERT-PRPS2干扰载体)与阴性对照组相比,PRPS2表达下调60％,CCK-8结果显示细胞活力明显下降(P＜0.05),Hoechst 33342染色后发现典型凋亡形态细胞,流式细胞术结果发现凋亡率显著上升(P＜0.05),细胞阻滞于G0/G1期(P＜0.05).结论 特异性下调U251细胞中PRPS2的表达,可降低细胞活力、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡.

目的:研究磷酸核糖焦磷酸合成酶2(PRPS2)在不同亚型乳腺癌中的表达及其与乳腺癌预后关系.方法:采用GEPIA数据库研究泛乳腺癌和正常乳腺组织中PRPS2 mRNA表达水平;使用UALCAN数据库基于患者年龄、是否绝经、乳腺癌不同分子亚型、不同组织亚型、病理分级和是否存在淋巴结转移等层面分析PRPS2在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达;采用miRTarBase数据库预测与PRPS23'UTR结合的miRNAs.应用Kaplan-Meier plotter数据库研究与PRPS2和PRPS23'UTR结合的miRNAs与乳腺癌预后的关系.结果:与正常乳腺组织比较,在不同亚型乳腺癌组织中PRPS2 mRNA表达水平明显升高(P<0.05);PRPS2 mRNA表达水平越高,乳腺癌患者的生存期越短.与正常乳腺组织比较,在不同亚型乳腺癌中PRPS23'UTR结合的hsa-miR-215-5p和hsa-miR-26b-5p表达水平均明显降低(P<0.05),hsa-miR-215和hsa-miR-26b表达水平越低,乳腺癌患者的生存期越短.结论:PRPS2具有泛乳腺癌特征性基因表达特点,乳腺癌中可能存在miR-PRPS2-乳腺癌预后的调控轴.

高尿酸血症(HUA)是由各种因素引起的尿酸生成过多或排泄减少,以血尿酸升高为特点的代谢性疾病.目前,HUA的发病机制尚不明确,除常见的外在因素(饮酒、高脂高糖饮食、疲劳、应激等)外,还包括遗传因素(如影响尿酸生成、排泄的基因).尿酸生成主要是由于磷酸核糖焦磷酸合成酶1过度激活以及次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1功能缺陷,影响其重吸收的基因包括溶质载体(SLC)22A/2A家族成员,影响其排泄的基因包括SLC22A/17A家族成员、ATP结合盒转运蛋白G超家族成员2等.深入研究HUA的遗传学进展,可为HUA的防治提供新思路.

目的 研究一个中国汉族X连锁Charcot-Marie-Tooth 病 5 型(CMTX5)综合征型听力损失家系的临床表型和分子病因.方法 分析一个中国汉族CMTX5综合征型听力损失家系的调查资料、临床检查结果 和遗传学特征,提取家系成员的外周血DNA,应用高通量测序筛选出候选致病基因,然后利用Sanger测序进行验证,确定病因,逆转录荧光定量PCR检测 PRPS1基因mRNA在先证者外周血的表达水平.结果 该家系共 2 代 4 人,先证者(Ⅱ-2,6岁)为先天性感音神经性听力损失及运动神经障碍的CMTX5 典型临床表型,但视力正常.全基因组测序发现一个尚未报道过的 PRPS1基因错义突变p.C60Y(c.179G>A),通过Sanger测序验证为新发突变,在各种物种中高度保守,而且符合X连锁遗传模式.结合既往 PRPS1基因型-表型关联情况,确定该突变为该家族综合征型聋的致病原因.PRPS1基因p.C60Y突变型在先证者外周全血中的mRNA表达水平与野生型无显著差异.结论 PRPS1基因p.C60Y突变为该X-连锁隐性遗传CMTX5综合征型听力损失家系的致病突变.