目的:探讨SD鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源外泌体(Exos)修复骺板缺损的相关机制。方法:通过超离心提取鼠BMSCs来源的Exos，制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)负载的Exos(PLGA-Exos)支架，扫描电镜对支架进行表征。提取鼠软骨细胞，探究PLGA-Exos/RAW264.7细胞/软骨细胞共培养体系中巨噬细胞及软骨细胞相关基因的表达。将24只SD大鼠随机均分为A、B、C 3组，构建胫骨近端骺板缺损模型，将PLGA负载的BMSCs-Exos缓释棒(A组)及无Exos负载的PLGA棒(B组)分别填塞于骺板缺损区，C组为对照组(无填塞)。术后6周获取鼠胫骨标本，通过影像学X线分析、苏木精-伊红(HE)染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及巨噬细胞表型蛋白[M1型：诱导型一氧化氮合酶(iNOS)；M2型：Arg-1]染色，评估骺板缺损的修复效果。两组间比较采用独立样本 t检验。 结果:PLGAs支架为三维多孔结构，孔隙分布均匀，具有较高的连通性。Exos被成功加载至PLGA中。PCR结果发现，在炎症微环境中，与对照组比较，BMSCs-Exos调控巨噬细胞高表达M2表型蛋白Arg-1(7.12±1.01比1.00±0.03， t＝10.47， P<0.01)，且促进软骨细胞COL-2及Sox9基因mRNA表达(8.25±0.74比1.00±0.12， t＝16.84， P<0.01；4.64±0.16比1.00±0.01， t＝38.64， P<0.01)。术后6周胫骨标本影像学及组织学分析显示，A组骺板缺损区可见结构致密、与正常骺板结构及功能相似新生透明软骨组织，B组骺板缺损区新生组织由大量的纤维组织及少量的透明软骨组成，C组骺板缺损区骨桥形成。骺板损伤区巨噬细胞相关的表型蛋白免疫组织化学染色显示，A组M2型巨噬细胞表型蛋白Arg-1染色呈阳性显色反应，M1型巨噬细胞表型蛋白iNOS染色为阴性；B组少量细胞质基质被Arg-1抗体染为弱阳性，iNOS染色为阴性；C组Arg-1抗体染色为阴性，而iNOS染色呈阳性反应。 结论:在炎症微环境中，BMSCs-Exos调控巨噬细胞向M2型编程，促进骺板缺损修复。

目的:通过高加速度离心加载装置建立高重力加载模型，探讨不同高重力加载环境对成骨细胞黏附及细胞骨架的影响，并且分析淫羊藿苷对高重力加载后细胞黏附和细胞骨架的影响。方法:将MC3T3-E1细胞按2×10 5个/cm 2的密度接种于细胞培养皿中。实验共分为6组：对照组、单纯给药组、10 G加载组、10 G给药组、40 G加载组、40 G给药组。加载组应用高加速度离心加载机对细胞施行加载，连续加载3 d，每天30 min。对照组和单纯给药组暴露于正常重力情况下，其余条件与实验组无差别。给药组淫羊藿苷均采用10 -7 mol/L浓度，且按预防给药的方法实验。通过茜素红染色、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性测定、CCK-8细胞增殖实验、细胞骨架鬼笔环肽染色、qPCR和Western Blot等相关分子生物学技术检测淫羊藿苷对高重力环境下成骨细胞integrin α5、integrin β1和F-actin的影响。 结果:所有模型均成功制备。茜素红染色：淫羊藿苷可促进成骨细胞钙化结节形成，10 G加载可促进成骨细胞矿化，而40 G加载则抑制成骨细胞的矿化。ALP活性检测：单纯给药组、10 G加载组、40 G加载组的检测OD值分别为0.246、0.331、0.163，与对照组的0.207相比，差异均有统计学意义（ P<0.05）；10 G给药组和40 G给药组分别为0.373和0.180，与各自加载组的差异有统计学意义（ P<0.05）。CCK-8增殖实验：单纯给药组OD值为0.650，与对照组0.551的差异有统计学意义（ P=0.031）；10 G加载组和40 G加载组OD值分别为1.193和0.245，与对照组的差异均有统计学意义（ P<0.05）；且10 G给药组和40 G给药组1.300和0.310，与各自加载组的差异有统计学意义（ P<0.05）。鬼笔环肽染色：10 G加载细胞促进的数量增加，但细胞形态及骨架未见明显变化，40 G加载则抑制，淫羊藿苷对细胞形态无影响，但对加载损伤后的细胞有一定修复作用。QPCR和Western Blot实验结果一致证实，淫羊藿苷作用后，integrin α5、integrin β1和F-actin的mRNA和蛋白表达上调，10 G加载可促进integrin α5、integrin β1和F-actin mRNA和蛋白的表达，40 G加载则明显抑制其mRNA和蛋白的表达。 结论:10 G条件和淫羊藿苷干预均可促进成骨细胞的生长发育、细胞黏附及细胞骨架的稳定，而40 G则具有明显抑制作用。

目的:以小动物离心机模拟飞行员高正加速度(+Gz)暴露环境,观察其对SD大鼠种植体骨结合的影响.方法:18只SD大鼠随机分为+Gz重复暴露组和对照组,每组9只,每只动物左右侧股骨远心端分别植入一枚纯钛种植体.术后24 h内实验组进入+Gz暴露环境,4～9 G 1 G/s逐渐增加,每周3次,对照组不作特殊处理.分别于2、4、8周随机处死两组各3只动物取材,进行micro CT扫描、双荧光标记和组织学分析,观察种植体周围骨结合情况.结果:2周时,+Gz重复暴露组骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、新骨沉积速率(MAR)、种植体-骨接触率(BIC)、种植体周围新骨生成量(BA)均显著低于对照组(P＜0.05),骨小梁间隙(Tb.Sp)显著高于对照组(P＜0.01);4周时,+Gz重复暴露组MAR、BA显著低于对照组(P＜0.05);8周时两组各指标均无统计学差异.结论:种植体植入后即刻进入+Gz重复暴露环境使SD大鼠骨结合初期形成速度减缓;但随着+Gz加载时间的延长,这种不利影响逐渐消退,最终达到与对照组相似的骨结合情况.

目的:探讨Klf10沉默对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,HPDLCs)受力后骨向分化的影响.方法:分离培养HPDLCs,RNA干扰沉默Klf10的表达,用离心加力法对细胞加载机械力,并予hedgehog信号通路特异性激动剂purmorphamine进行干预.采用ELISA法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,采用RT-PCR和Western印迹法分别检测各组细胞Klf10 mRNA和蛋白表达水平,并检测成骨标志基因Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨钙素(osteocalcin,OCN)mRNA和蛋白的表达情况;利用Western免疫印迹法检测hedgehog信号转导通路成员胶质瘤相关癌基因同源物1(glioma-associated oncogene homolog 1,GLI1)和Ptch1 (patched-1)的蛋白表达.采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析.结果:机械力诱导6h后,Klf10、Runx2、OPN和OCN mRNA和蛋白的表达显著升高,ALP活性升高,GLI1和Ptch1蛋白表达升高(P＜0.05).与空白组相比,转染Klf10 siRNA组Klf10 mRNA和蛋白水平显著降低(P＜0.05).同时,Klf10 siRNA显著抑制ALP活性,下调Runx2、OPN和OCN mRNA和蛋白的表达,抑制GLI1和Ptch1蛋白表达(P＜0.05).Purmorphamine显著抑制Klf10 siRNA沉默介导的成骨分化效应(P＜0.05).结论:Klf10沉默可以抑制机械力作用下HPDLCs的骨向分化,可能与调节hedgehog信号转导通路有关.

目的:探讨周期性机械离心应力刺激对兔骨膜细胞与骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨矿化的影响.方法:取兔颅骨骨膜细胞、股骨骨髓细胞体外原代培养,传至第3代后分为加力组和对照组.加力组使用低速离心机加载离心力(10 min/d),分别为170、210、250 g.对照组置于超净台(10 min/d)常规培养1、3、5、7、9 d.测定各组细胞成骨矿化能力、ALP活力及细胞增殖情况;实时荧光定量PCR法测定两种细胞成骨相关基因骨钙素(OCN)和RUNX2的mRNA相对表达量.结果:在不同周期性机械离心力的刺激下,骨膜细胞和BMSCs的增殖活性、ALP活性均有不同程度的提高;其中两种细胞250 g组的增殖活性、ALP活性升高显著(P<0.05);骨膜细胞和BMSCs的加力实验组,除BMSCs 210 g组的矿化结节数目与对照组相比无统计学差异外(P>0.05),其余各组形成的矿化结节数目、OCN和RUNX2的mRNA相对表达量均较对照组显著增加(P<0.05).结论:适宜大小的周期性机械离心力刺激可促进兔骨膜细胞、BMSCs体外增殖和矿化.

目的 探讨离心重力对人脂肪来源间充质干细胞(hADSCs)向软骨样细胞分化以及对 Wnt/β-catenin信号通路的影响.方法 通过加载不同离心力(0、500、1000、2000、2500、3000 × g)和持续时间(0、15、30、45、60 min)刺激脂肪干细胞分化为软骨样细胞,并利用荧光定量 PCR 和Western blot 检测 Sox 9 基因的上调表达来筛选条件,将培养的 P3代 hADSCs 分 3 组,对照组(不干预处理)、离心重力组和 TGF-β3 组(加入 TGF-β3 成软骨诱导剂),持续培养 21 d 后,通过阿利辛蓝和苏木精-伊红染色进行软骨分化鉴定,DMMB 法测定胞外基质中 GAG 含量,荧光定量 PCR 测定 II 型胶原基因表达,Western blot 进一步检测对照组和离心重力组中 Sox 9、β-catenin、GSK3β 和p-GSK3β 蛋白的表达.结果 加载最适的离心重力(2500 × g,30 min)刺激hADSCs 后,培养 24 h,Sox 9 的 mRNA 和蛋白表达显著上调.阿利辛蓝和苏木精-伊红染色显示,离心重力组和TGF-β3 组中软骨表达呈阳性.GAG 实验结果显示, TGF-β3 组促 GAG 分泌的能力优于离心重力组(P <0.05),荧光定量 PCR 结果表明 TGF-β3 组其 II 型胶原mRNA 表达的能力高于离心重力组(P < 0.05),Western blot结果显示,相比对照组,离心重力组中 β-catenin 和p-GSK3β 的蛋白表达水平降低,而 GSK3β 和 Sox 9 蛋白表达升高.结论 离心重力和 TGF-β3 诱导脂肪干细胞成软骨分化中的表达具有相似的能力,离心重力对 hADSCs 诱导成软骨作用与抑制 Wnt/β-catenin 信号通路有关.

目的:比较三种具有不同多肽构象的融合肽对金属钛表面的亲和性及其对轻力负载下细胞反应的双向生物学功能.方法:设计3种不同多肽构象的融合肽:TBP-RGD,TBP-cyclicRGD(含有环状结构RGD)和TBP-lin-erRGD(含有线性结构RGD);利用石英晶体微天平(QCM-D)比较3种融合肽在钛表面的结合能力;通过MC3T3-E1成骨细胞黏附、增殖实验比较了融合肽对离心力负载下细胞的生物反应.结果:QCM-D显示TBP-cyclicRGD与金属钛表面的亲和性最强,而TBP-linerRGD最弱;经过融合肽涂层修饰的钛表面,48 h时TBP-cyclicRGD促细胞增殖最强.结论:构成单元中不同多肽构象的融合肽对钛表面的结合力有差异,其中环状构象的TBP-cyclicRGD能显著提高融合肽对金属钛的识别和结合能力,并有助于提高成骨细胞在力学负载条件下的增殖活动.

背景:载人航天器发射与返回、舰载机的起飞与降落,会使航天员、飞行员处在高加速度(超重)环境中,高加速度环境会对细胞、器官、动物体等产生重要影响.高加速度离心加载机是一种可以为动物个体及细胞提供高加速度力学环境的装置,在航空航天的力学生物学、组织工程研究中起基础平台作用,目前通常生物学实验室需要高加速度加载装置.目的:结合现有离心机,设计制作大鼠高加速度离心加载机,研究大鼠在高加速度力学环境下的力学生物学响应.方法:离心机设计制作流程:确定设计参数、选择动力源→设计离心机结构并验证→选择制作控制器→加工制作机器并调试.对大鼠进行水平和竖直放置方向的加载,每个方向设置了4 G组、8 G组、10 G组、20 G组4个小组和一个对照组,观察不同高加速度环境对大鼠身体和行走能力的影响.结果与结论:①经过结构设计加工、配件选型和安装调试研制出高加速度加载机,设备包括机械结构与控制系统两部分;该机运行平稳,噪声低,平稳实现0-40 G的高加速度加载,并且还可实现变加速度加载;②采用该机对大鼠进行不同高加速度环境加载后,表现出身体向一侧倾斜,不能直线行走的现象,并且伴随战栗、后肢充血等症状,高加速度值越大,大鼠所受的影响越大,经过一段时间休息,大鼠身体基本可以恢复;③实验结果验证了该离心加载机可以为动物实验提供相应的高加速度环境,可以用于研究高加速度环境下动物的力学生物学响应.

背景:随着中国航天事业的发展,飞行员面临承受高G力学环境,这种环境会对飞行员骨骼造成严重影响.而胫骨作为最容易发生骨折的骨骼之一,目前对极端力学环境下胫骨生物力学研究较少.目的:通过高G离心加载装置制作动物模型,探究不同高G力学环境对大鼠生长发育和胫骨力学性能的影响.方法:取解放军军事医学科学院实验动物中心提供的雄性Wistar大鼠,通过高G离心加载装置设置悬臂以不同的转速和加速度运行模拟高G环境,并制作动物模型.每周称量大鼠体质量.取大鼠左侧胫骨进行三点弯曲实验,计算胫骨挠度、弹性模量、极限载荷;右侧胫骨进行蠕变实验,在胫骨中段皮质骨表面施加恒定应力并保持3600 s,观察其蠕变应变变化.实验已由天津理工大学动物伦理委员会批准.结果与结论:高G环境会影响大鼠正常生长发育,抑制体质量增长并降低了大鼠胫骨的力学性能,使胫骨的极限挠度分别下降了8.1％,12.2％,37.8％,51.4％;极限载荷分别下降了16％,9％,25.2％,29％.说明极端高G环境会对大鼠产生严重的负面作用.

目的:运用加载miRNA34a的外泌体治疗口腔鳞状细胞癌.方法:采用超速离心的方法从HEK293细胞的培养上清液中提取外泌体,结合透射电子显微镜、纳米粒子追踪分析仪、Western blot实验鉴定外泌体,进而利用共孵育的方法将疏水性修饰的miRNA34a模拟物加载到外泌体中,以构建含miRNA34a的外泌体(exo-miRNA34a),倒置荧光显微镜下观察加载效率.将exo-miRNA34a接种于口腔鳞癌细胞HN6中,利用激光共聚焦显微镜观察HN6细胞对外泌体的摄取,结合CCK-8实验检测HN6细胞增殖的变化.结果:在HEK293细胞培养上清液提取物中观察到40～150 nm大小的小囊泡,囊泡粒径分布峰值为97.9 nm;肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)和CD63表达阳性,钙联蛋白(Calnexin)表达阴性.疏水改性的miRNA34a可有效加载到外泌体中,载药率约为47％,载药后外泌体粒径增加,其完整性不受影响.exo-miRNA34a可以进入HN6细胞中,对HN6细胞的增殖具有明显抑制作用(P<0.05).结论:外泌体介导的miRNA34a可明显抑制口腔鳞癌HN6细胞的增殖.