目的:总结2例线粒体精氨酰tRNA合成酶（RARS2）基因变异致早发癫痫脑病患儿的临床特征并进行文献复习。方法:回顾性分析2017年1月至2018年12月首次就诊于首都医科大学附属北京儿童医院神经内科的2例RARS2基因变异致脑桥小脑发育不良6型（PCH6）患儿的临床特征和基因变异位点。以“RARS2”“pontocerebellar hypoplasia type 6”“early onset epileptic encephalopathy”为检索词，检索中国知网、万方数据库及PubMed数据库（建库至2020年5月），选取有RARS2基因变异且临床资料完整的文献进行复习总结该病临床特征。结果:2例（例1男、例2女）患儿分别在2月龄和29日龄以早发癫痫脑病起病，临床表现为癫痫、发育落后、小头畸形和血乳酸升高。例2还伴有生后呼吸困难、低血糖、代谢性酸中毒。2例患儿起病时头颅磁共振成像均正常，分别在4月龄（例1）和8月龄（例2）复查提示大、小脑萎缩，无脑桥萎缩改变。全外显子测序发现例1（p.Arg560His， p.Arg6His）和例2（p.Arg254Trp， p.Phe5Ser）在RARS2基因杂合变异，均为未报道的新变异。检索符合条件的英文文献17篇，无中文文献。排除资料不全病例，共有20个家系34例PCH6（包括本组2例）。所有患儿均有不同程度的发育落后，94%（32/34）在3月龄内起病，93%（28/30）伴发癫痫，89%（25/28）有渐进性小头畸形。药物难治性癫痫占71%（20/28）。共发现31个变异位点，以错义变异为主（68%，21/31）。结论:RARS2基因变异致PCH6多于3月龄内发病，以早发癫痫脑病为特征，多数为药物难治性癫痫，伴发育落后、小头畸形和乳酸升高，头颅磁共振成像提示大脑或脑桥小脑渐进性萎缩。

目的:探讨缺血预处理对脑梗死大鼠脑细胞的保护作用及其机制。方法:120只SD大鼠按随机数字表法分为缺血预处理组(50只)、脑梗死组(50只)、假手术组(10只)、正常组(10只)，前2组大鼠采用改良Longa线栓法制备大脑中动脉闭塞(MCAO)致脑梗死模型(缺血预处理组大鼠在造模前将线栓置入大脑中动脉阻断血流15 min)，假手术组大鼠行假缺血预处理和假阻断大脑中动脉血流，正常组大鼠不做任何处理。分别于正常组和假手术组造模后24 h，缺血预处理组和脑梗死组造模后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h，每组取10只大鼠，采用TUNEL染色检测小鼠缺血半暗带区细胞凋亡率，免疫组化染色检测小鼠缺血半暗带区含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)的表达，RT-PCR和Western blotting法分别检测小鼠缺血半暗带区精氨酰-tRNA合成酶( ArgRs)基因和ArgRs蛋白的表达。 结果:与正常组和假手术组比较，脑梗死组大鼠造模后不同时间点缺血半暗带区细胞凋亡率、Caspase-3阳性表达率、 ArgRs基因和ArgRs蛋白的表达均明显升高，差异均有统计学意义( P<0.05)。与脑梗死组比较，缺血预处理组大鼠造模后不同时间点缺血半暗带区细胞凋亡率、Caspase-3阳性表达率、 ArgRs基因和ArgRs蛋白的表达均明显降低，差异有统计学意义( P<0.05)。 结论:脑缺血预处理可以抑制脑梗死大鼠脑缺血半暗带区 ArgRS基因及ArgRS蛋白、Caspase-3的表达，减少脑细胞的凋亡，从而起到脑保护作用。

目的:研究线粒体精氨酰-tRNA合成酶(RARS2)基因表达对胰腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及化疗敏感性的影响。方法:人胰腺癌细胞株AsPC-1及PANC-1分别设置阴性对照组、RARS2干扰组-1、RARS2干扰组-2、过表达对照组、RARS2过表达组，通过瞬时转染法降低或过表达RARS2。细胞计数CCK-8法检测细胞增殖以及化疗敏感性，采用Transwell检测细胞侵袭及迁移。采用Western印迹检测RARS2在不同浓度及不同时间吉西他滨作用下的表达。Western印迹与聚合酶链式反应检测耐药株RARS2表达。结果:在胰腺癌细胞AsPC-1及PANC-1中，干扰降低RARS2的表达可以显著抑制细胞增殖能力，增强吉西他滨化疗敏感性；过表达RARS2后细胞增殖能力增强，吉西他滨化疗敏感性降低。在AsPC-1细胞中，阴性对照组、RARS2干扰组-1、RARS2干扰组-2、过表达对照组、RARS2过表达组迁移细胞数(100倍显微镜下)(586.7±37.4)个/视野、(195.7±18.6)个/视野、(237.0±17.1)个/视野、(157.7±19.1)个/视野、(456.0±23.1)个/视野，侵袭细胞数分别为(87.7±13.2)个/视野、(24.7±6.5)个/视野、(31.7±6.1)个/视野、(29.3±4.5)个/视野、(94.3±9.3)个/视野。降低RARS2表达后细胞迁移与侵袭能力降低，过表达RARS2细胞迁移与侵袭能力增强。聚合酶链式反应与Western印迹实验表明，吉西他滨耐药株AsPC-1中RARS2的相对表达高于普通细胞株。在AsPC-1细胞中，随着吉西他滨浓度及处理时间增加，RARS2表达随之上升。结论:RARS2基因调控胰腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移及化疗敏感性，且RARS2表达与吉西他滨浓度与处理时间正相关。

赖氨酸酰化修饰在细胞中普遍存在,控制着蛋白质的多种功能;然而,在活细胞中进行特定位点酰化修饰的生物学功能研究还存在困难.近年来发展的遗传密码子拓展(genetic code expansion,GCE)技术通过正交的氨酰基-tRNA合成酶/tRNA能够在活细胞内定向插入与天然酰化修饰结构一致的非天然氨基酸(unnatural amino acids,UAAs),实现在精准引入酰化修饰的基础上研究目的蛋白的理化性质和生物学行为的改变.此外,GCE技术还能定点引入无法被去酰化酶识别的模拟酰化修饰的UAAs,从而提高目的蛋白赖氨酸酰化修饰产物的稳定性.在目的蛋白特定位点插入"光交联"型UAA则被用于阐明酰化修饰蛋白的互作蛋白质组.根据不同结构和功能的酰化修饰分类,分别阐述了GCE技术结合上述3类UAAs的新颖设计,及其在研究蛋白酰化修饰对目的蛋白的活性、稳定性、细胞定位、蛋白质-DNA相互作用和蛋白质-蛋白质相互作用等功能影响中的应用.最后,展望了GCE技术在蛋白质酰化修饰研究中的局限和应用前景.

目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是好发于中老年的浆细胞恶性肿瘤,发病机制尚不清楚.由于其多发、复发、耐药的特点,MM仍是一种无法治愈的疾病.氨基酸代谢异常是MM的重要特征之一.氨基酸重要的代谢途径是作为基本原料参与蛋白质合成.氨酰转移核糖核酸合成酶(aminoacyl transfer ribonucleic acid synthetase,ARS)基因是蛋白质合成过程中的关键调节基因.本研究旨在探究在MM中异常表达的氨基酸代谢关键因子ARS通过调控氨基酸代谢影响MM生长的分子机制.方法:对应基因编号合并基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中基因表达谱GSE5900数据集及GSE2658数据集数据,对ARS家族基因表达数据进行标准化处理.采用GSEA_4.2.0软件分析健康供者(healthy donor,HD)与MM患者基因富集的差异.采用GraphPad Prism 7绘制基因热图并进行数据分析.采用Kaplan-Meier及Cox回归模型分别对ARS家族基因表达与MM患者预后情况进行单因素及多因素回归分析.收集7例MM初诊患者的骨髓样本,使用CD138抗体磁珠分选获得CD138+、CD138-细胞,采用real-time RT-PCR分析ARS在MM临床样本中的表达情况.以人B淋巴细胞GM12878细胞,人MM细胞系ARP1、NCI-H929、OCI-MY5、U266、RPMI 8266、OPM-2、JJN-3、KMS11、MM1.s细胞为研究对象,采用real-time RT-PCR及蛋白质印迹法分析ARS在MM细胞系中的表达情况.利用短发夹核糖核酸(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒构建基因敲减质粒(VARS-sh组),将其与空载质粒(scramble组)分别转染HEK 293T细胞后进行病毒包装,分别感染ARP1、OCI-MY5细胞并建立稳定表达的细胞系,分别采用细胞计数法和流式细胞术检测敲减缬氨酰tRNA合成酶(valyl-tRNA synthetase,VARS)基因对MM细胞增殖和凋亡的影响.根据VARS表达将GEO数据分为高表达组和低表达组,通过生物信息学分析探索VARS影响的下游通路,采用飞行时间质谱(gas chromatography time-of-flight/mass spectrometry,GC-TOF/MS)及高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分别检测临床患者骨髓样本CD138+细胞及敲减VARS基因的ARP1、OCI-MY5细胞及上清液中缬氨酸含量.结果:基因富集分析结果表明:与HD相比,tRNA加工相关的基因在MM中显著富集(P<0.0001).进一步筛选tRNA加工通路相关子集发现胞质氨酰tRNA合成酶家族基因在MM中显著富集(P<0.0001).基因表达热图结果表明GEO数据中ARS家族基因除丙氨酰tRNA合成酶(alanyl-tRNA synthetase,AARS)、精氨酰tRNA合成酶(arginyl-tRNA synthetase,RARS)、丝氨酰tRNA合成酶(seryl-tRNA synthetase,SARS)外,其余ARS家族基因均在MM中高表达(均P<0.01),且随着意义未明单克隆丙种球蛋白血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance,MGUS)到MM的发展进程,基因表达水平逐渐增加.Kaplan-Meier生存情况单因素分析结果表明甲硫氨酰tRNA合成酶(methionyl-tRNA synthetase,MARS)、天冬酰胺基tRNA合成酶(asparaginyl-tRNA synthetase,NARS)、VARS高表达组与低表达组MM患者预后情况差异均具有统计学意义(均P<0.05).Cox回归模型多因素分析结果表明:VARS的高表达与MM的总生存时间异常有关(HR=1.83,95%CI 1.10～3.06,P=0.021);NARS(HR=0.90,95%CI 0.34～2.38)及MARS(HR=1.59,95%CI 0.73～3.50)的高表达均对MM患者的总生存时间无影响(均P>0.05).Real-time RT-PCR及蛋白质印迹法结果表明VARS、MARS和NARS在临床患者CD138+MM细胞及MM细胞系中均高表达(均P<0.05).细胞计数法及流式细胞术结果表明,敲减VARS的MM细胞增殖能力被显著抑制(P<0.01),细胞凋亡率明显升高(P<0.05).生物信息学分析结果表明除包括细胞周期在内的通路受VARS调控外,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸分解代谢通路被上调.非靶向代谢组学数据表明:与HD相比,MM患者的CD138+MM细胞中缬氨酸含量降低(P<0.05).HPLC结果表明:与scramble组相比,VARS-shRNA组的ARP1细胞与培养基上清液及OCI-MY5培养基上清液中缬氨酸含量均增加(均P<0.05).结论:VARS在MM中异常高表达,且与MM患者的不良预后相关.VARS可通过影响缬氨酸代谢调控促进MM细胞的生长.

目的 基于异病同治理论探究经典名方真武汤治疗心肾交集性疾病的网络药理学分子机制.方法 综合利用中药整合药理学计算平台(TCM-IP)的中药材数据库、中药成分数据库和疾病靶标数据库的数据信息和分析功能,对真武汤治疗慢性心衰和糖尿病肾病的作用靶标、信号通路进行预测,分析二者的作用靶点、信号通路之间的关联性,探究该方“异病同治”治疗心肾交集性疾病的分子机制.结果 对真武汤预测共得到280个活性成分,包括生物碱、皂苷、内酯、有机酸等成分;筛选出治疗慢性心衰115个核心靶标,治疗糖尿病肾病175个核心靶标,其中共同靶标包括谷氨酸脱羧酶2(GAD2)、葡萄糖激酶(GCK)、谷氨酰-脯氨酰-tRNA合成酶(EPRS)、细胞色素C氧化酶5A抗体(COXSA)、AMPA离子能谷氨酸受体2(GRIA2)等;涉及谷氨酸能突触、神经系统、精氨酸和脯氨酸代谢、苯丙胺成瘾以及血管内皮生长因子信号通路、酪氨酸激酶受体信号通路、促性腺激素释放激素信号通路等相关生物过程和信号通路.结论 推测真武汤通过调节中枢神经“下丘脑-垂体”系统、内分泌和血液循环系统维持全身体液平衡,保持内环境稳定,并介导能量代谢和炎症反应过程达到治疗心肾交集性疾病目的,为进一步深入研究其作用机理提供了科学依据.

目的 建立重组结核分枝杆菌ArgRS的制备方法,并验证重组蛋白的生物活性.方法 将结核分枝杆菌Ar-gRS基因插入到pQE60质粒中,通过IPTG诱导表达重组蛋白,使用分子筛制备重组蛋白,并评价重组蛋白分子量.使用圆二色谱评价重组蛋白的折叠情况.通过Thermal Shift Assay进一步验证重组蛋白的生物活性.采用气相扩散法筛选晶体.结果 使用pQE60载体获得了重组表达的ArgRS蛋白.凝胶过滤层析纯化重组蛋白并验证了其分子量与天然蛋白一致;Thermal Shift Assay证明重组蛋白的生物活性.使用气相扩散法获得结核分枝杆菌ArgRS分子晶体.结论 成功制备出具有天然活性的重组结核分枝杆菌ArgRS蛋白,并获得蛋白质晶体.

患者女性,14岁,于2019年1月16日因晕厥、意识不清半天入院.查体:生命体征平稳,意识模糊,言语障碍,颈抵抗阳性,心肺腹未见明显异常,右侧肢体肌力3级,左侧肢体肌力0级,双侧Babinski征阳性.实验室检查:血细胞沉降率(ESR)61 mm/h,补体C30.28 g/L,C40.01 g/L,抗核抗体(ANA):320,抗ds-DNA抗体800 U/L,抗Sm抗体阳性、抗核糖体P蛋白补体(抗μ1RNP)阳性、抗Ro-52抗体阳性,抗核糖核蛋白抗体(rRNP)阴性,抗心磷脂总抗体(ACL)阴性,抗中性粒细胞浆抗体(ANCA)、抗干燥综合征抗原A抗体(SSA)、抗干燥综合征抗原B抗体(SSB)、抗拓扑异构酶抗体(抗Scl70)、抗组氨酰tRNA合成酶抗体(Jo-1)阴性.血常规正常,尿蛋白阴性,肾功能正常.