目的:探讨CD8 ＋T细胞在抵抗致死型约氏疟原虫17XL( Plasmodium yoelii 17XL, Py 17XL)感染中的作用。 方法:对BALB/c和C57BL/6小鼠腹腔接种 Py 17XL感染红细胞(1×10 6个/0.1 ml)，建立疟原虫感染模型。动态监测小鼠红细胞感染率、生存率。流式细胞术检测CD8 ＋T细胞亚群效应T细胞(T EFF)和记忆T细胞(T CM)数量，检测IFN-γ和颗粒酶B(granzyme B，GB)表达水平，及CD8 ＋T细胞表面CXCR3、CXCR6和CX3CR1表达水平。对 Py 17XL感染C57BL/6小鼠进行FTY720阻断试验，分析CD8 ＋T细胞迁移对 Py 17XL感染的影响。 结果:BALB/c小鼠红细胞感染率在感染后5 d持续上升，8 d达峰值[(79.57±3.82)%]，且明显高于C57BL/6小鼠( P<0.000 1)，感染后9 d小鼠全部死亡。C57BL/6小鼠红细胞感染率在14 d达峰值[(48.19±3.19)%]后逐渐降至0(26 d)，两组生存率差异有统计学意义( P<0.000 1)。流式结果显示，与BALB/c小鼠相比，C57BL/6小鼠脾脏和肝脏CD8 ＋T细胞绝对值数量显著增加( P<0.05)，脾脏和淋巴结CD8 ＋T EFF和CD8 ＋T CM细胞数量显著升高( P<0.05)。与BALB/c小鼠相比，C57BL/6小鼠脾脏和肝脏CD8 ＋T细胞表达GB、IFN-γ及趋化因子水平显著升高( P<0.05)。FTY720阻断试验显示，实验组小鼠生存率显著性下降( P<0.05)，肝脏和脾脏CD8 ＋T细胞绝对数明显下降( P<0.05)；且CD8 ＋CXCR3 ＋T细胞数量显著下调( P<0.05)。 结论:CD8 ＋T细胞通过T EFF和T CM亚群以分泌GB和IFN-γ方式介导抵抗 Py 17XL感染。趋化因子受体CXCR3在介导CD8 ＋T细胞向脾脏和肝脏趋化中发挥重要作用。

目的 克隆、表达驽巴贝虫精氨酸/赖氨酸特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(BcMC),鉴定其反应原性并分析其生物学信息.方法 根据驽巴贝虫部分基因序列设计并合成Bcmc基因扩增引物,采用PCR扩增Bcmc基因并克隆至原核表达载体pET-28a,提取质粒pET-28a-Bcmc进行双酶切、PCR和测序鉴定,将重组质粒转入感受态细胞大肠埃希菌BL21(DE3),优化诱导条件后,选择最适异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、诱导温度和时间诱导,采用12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的表达情况.用His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白后,以驽巴贝虫感染阳性马血清为一抗,Western blotting分析重组蛋白的反应原性.采用ProtParam等生物信息学在线软件预测Bcmc基因的理化性质、磷酸化位点、亚细胞定位、抗原表位、二级和三级结构、蛋白互作网络,对比BcMC与疟原虫属MC-1(PsMC-1)和泰氏锥虫MC(TtMC)的三级结构.Bcmc序列在NCBI上进行BLAST比对,使用Mega 7.0软件,采用邻接法构建基于mc基因序列的系统进化树.结果 Bcmc基因PCR扩增产物约为996 bp,与预期片段一致.重组质粒pET-28a-Bcmc经双酶切、PCR和测序鉴定表明插入的目的基因正确.诱导条件优化结果显示,BcMC重组蛋白在IPTG终浓度为0.8 mmol/L、37 ℃培养5 h时的表达量最高.SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以包涵体的形式表达,相对分子质量(Mr)约为36 000.Western blotting结果表明,纯化后的BcMC可与驽巴贝虫感染阳性马血清发生特异性反应.生物信息学分析结果显示,BcMC的Mr为36 956.72;具有25个磷酸化点位;亚细胞定位预测位于线粒体的比例为10％;B细胞抗原表位分析发现该蛋白含有12个潜在抗原表位;BcMC蛋白的二级结构中,无规则卷曲占50.30％、α-螺旋占23.19％;BcMC的三级结构与PsMC-1和TtMC相似;蛋白互作网络预测结果显示,与BcMC相互作用的蛋白及BcMC参与的生物过程均与细胞凋亡有关.BLAST比对结果和系统进化树分析结果显示,Bcmc与马泰勒虫(CP099439)、马泰勒虫WA株(XM_004830992)的mc基因序列一致性均为99.90％,进化树上聚为一支,亲源关系较近.结论 BcMC原核表达蛋白具有良好的反应原性,生物信息学分析表明BcMC参与驽巴贝虫凋亡的生物过程.

目的 探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响.方法 分别提取Hepa1-6和HepG2-CD81细胞RNA,逆转PCR扩增C3、C3aR1、C5、C5aR1基因.Hepa1-6细胞和HepG2-CD81细胞悬液分别加入蛋白酶和磷酸酶裂解,2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法测定蛋白浓度,用蛋白质免疫印迹(Western blotting)测定肝细胞内补体和受体表达情况.将表达红色荧光蛋白(RFP)的约氏疟原虫BY265-RFP株、伯氏疟原虫ANKA株的昆明小鼠供斯氏按蚊吸血,17～19 d后解剖分离斯氏按蚊唾液腺,收集子孢子,在24孔板中按50 000个子孢子/孔加入HepG2-CD81细胞(105个/孔)孵育6、12、24 h;另设置共孵育3 h后加入C5aR拮抗剂(40nnmol/L,每孔500 μ1)的组别.经4％多聚甲醛固定、封闭,非透膜组加入一抗C3a兔抗人IgG抗体(1∶500)或rC5a兔抗人IgG抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜,加入绿色Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入DAPI染色液孵育5 min;透膜组加入一抗UIS4山羊多克隆抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜,加入绿色IFKine?荧光标记的驴抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1h,加入CD88兔多克隆抗体(1∶400)4 ℃孵育过夜,加入红色Dylight 649荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1h,加入DAPI染色液孵育5 min,激光共聚焦显微镜观察补体在纳虫空泡周围的富集情况.取眼镜蛇毒因子(CVF)腹腔注射至C57BU6小鼠,为CVF组;并设置C3-/组(C3全基因敲除C3-/-小鼠)和对照组(C57BU6小鼠).取10 000个约氏疟原虫子孢子感染各组小鼠,取肝脏提取总RNA后逆转录合成cDNA,荧光定量PCR测定疟原虫18S rRNA含量,肝脏虫荷用18S rRNA的相对含量表示.以尾静脉注射方式,用200个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BU6小鼠)10只、C3aR-/-小鼠10只;1 000个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BU6小鼠)5只、C5aR全基因敲除C5aR-/-小鼠6只和肝脏C5aR条件性敲除Alb-cre+/+C5aRflox/flox杂交小鼠5只;1 000个伯氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BU6小鼠)6只和C5aR-/-小鼠6只,感染后3d开始取尾静脉血,制成薄血膜涂片,吉氏染色后观察,至所有小鼠均出现红内期疟原虫为止.采用Graphpad prism 9.0软件进行统计学分析.正态分布的数据采用t检验比较连续变量,两两差异比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行多重比较;非正态分布数据比较采用Mann-Whitney U检验.结果 PCR结果可见,Hepa1-6细胞株内扩增出C3(358 bp)、C5(267 bp)及其受体C3aR(222 bp)、C5aR(388 bp)基因;HepG2-CD81 细胞株内扩增出 C3(202 bp)、C5(220 bp)、C3aR(299 bp)和 C5aR(374 bp)基因.Western blotting 检测结果发现,两种细胞均有 C3、C5、C3aR和C5aR蛋白表达.激光共聚焦显微镜成像可见,细胞核经DAPI染色呈蓝色荧光,约氏疟原虫红外期呈红色自发荧光,非透膜组HepG2-CD81细胞内高表达的C3a和C5a呈绿色荧光,与纳虫空泡分布区域重叠;透膜组C5aR(粉色)与纳虫空泡膜(绿色)重叠;加入C5aR拮抗剂组别的纳虫空泡膜上仍有C5aR表达.约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、CVF组、C3-/-组的肝脏虫荷(18S rRNA相对含量)分别为0.954±0.523、0.958±0.231、0.638±0.437,3组间差异均无统计学意义(P＞0.05).约氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C3aR-/-小鼠分别在(5.30±0.78)d和(5.30±0.78)d后出现红内期;伯氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C5aR-/-小鼠分别在(3.67±0.47)d和(3.83±0.69)d后出现红内期;2组基因敲除小鼠红内期出现时间与对照组相比,差异均无统计学意义(P＞0.05).约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、Alb-cre+/+C5aRflox/flox小鼠和C5aR-/-小鼠红内期的出现时间分别为(4.00±0.00)、(4.00±0.00)、(4.17±0.37)d,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 肝细胞局部补体活化对疟原虫红外期发育无显著影响.

目的 用约氏疟原虫(P.y)BY265株和伯氏疟原虫(P.b)ANKA-luciferase株感染小鼠和大鼠,分析鼠疟原虫感染宿主的种特异性.方法 制备P.y和P.b的子孢子和裂殖子.分别用5×104的P.y和P.b子孢子经尾静脉注射感染SD大鼠、BALB/c小鼠(P.y感染组,5只/组)和SD大鼠、C57BL/6J小鼠(P.b感染组,5只/组),每日取尾静脉血涂片镜检,记录红内期疟原虫出现的时间.P.y子孢子感染SD大鼠和BALB/c小鼠后42 h取肝组织,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肝组织疟原虫18S rRNA的相对表达量.P.b子孢子感染SD大鼠和C57BL/6J小鼠后42 h活体成像法检测肝脏荧光值.分别用1 × 108、1 × 107、1 × 106的P.y和P.b被感染红细胞(iRBC)感染SD大鼠(P.y感染组、P.b感染组)和易感小鼠(BALB/c、C57BL/6J)(阳性对照组),每日取尾静脉血涂片镜检,计算原虫血症.分别用P.y、P.b裂殖子感染SD大鼠和易感小鼠,每日取尾静脉血涂片镜检,计算原虫血症;当大鼠、小鼠原虫血症达到峰值后,每隔8小时取尾静脉血涂片镜检,持续24h,分析疟原虫发育节律;观察大鼠、小鼠实验性脑型疟(ECM)的发生情况.分别用P.y、P.b裂殖子感染T、B细胞缺陷的Rag2-KO SD大鼠、野生型SD大鼠和易感小鼠,每日取尾静脉血涂片观察,计算原虫血症.两组数据之间比较采用非配对t检验,组间原虫血症趋势比较采用双因素方差分析(two-way ANOVA).结果 P.y感染组的SD大鼠、BALB/c小鼠,P.b感染组的SD大鼠、C57BL/6J小鼠体内疟原虫均能完成肝期发育,于第3天进入红内期.qRT-PCR结果显示,P.y子孢子感染SD大鼠、BALB/c小鼠体内疟原虫特异性18S rRNA相对表达量分别为(1.63±0.381)、(1.00±0.232),二者差异有统计学意义(t=2.801,P＜0.05).活体成像结果显示,P.b子孢子感染SD大鼠体内荧光度值为(6.243±1.425)× 107,高于C57BL/6J小鼠的(1.624±0.530)× 107(t=6.077,P＜0.01).红内期iRBC感染结果显示,3种剂量的P.y感染组SD大鼠的原虫血症趋势[峰值分别为(3.500±1.042)％、(2.850±0.627)％、(3.400±0.962)％]之间差异无统计学意义(F=0.145,P＞0.05),但与阳性对照组[峰值为(43.928±9.448％)]差异有统计学意义(F=84.040、63.760、58.400,均P＜0.01);P.b感染组SD大鼠的原虫血症趋势[峰值分别为(11.468±1.362)％、(7.398± 2.387)％、(2.984±1.881)％]随感染剂量降低而下降,其中1 × 108、1 × 106剂量组原虫血症趋势与阳性对照组[峰值为(10.682±4.278)％]差异有统计学意义(F=13.83、17.320,均P＜0.01),1 × 107剂量组原虫血症趋势与阳性对照组差异无统计学意义(F=2.234,P＞0.05).裂殖子感染结果显示,感染后6d,P.y感染组SD大鼠、BALB/c小鼠原虫血症分别为(0.902±0.235)％、(17.420±4.105)％,二者差异有统计学意义(t=9.943,P＜0.01);P.b感染组SD大鼠、C57BL/6J小鼠原虫血症分别为(6.804±2.978)％、(9.290±1.055)％,二者差异无统计学意义(t=1.759,P＞0.05);P.b感染组SD大鼠、C57BL/6J小鼠ECM累计发生率分别为11/15、13/15,二者差异无统计学意义(t=1.414,P＞0.05).发育节律分析结果显示,P.y感染组SD大鼠发育节律与BALB/c小鼠不同,未呈现24h规律;P.b感染组SD大鼠发育节律与C57BL/6J小鼠相近,具有24h规律.感染后18 d,P.y感染组Rag2-KO SD大鼠、野生型SD大鼠、BALB/c小鼠原虫血症分别为(1.326±0.908)％、0、(33.937±3.453)％,Rag2-KO SD大鼠与野生型SD大鼠之间原虫血症差异有统计学意义(t=2.267,P＜0.05);感染后17d,P.b感染组Rag2-KO SD大鼠、野生型SD大鼠的原虫血症为(19.685±5.752)％、(0.007±0.013)％(t=2.499,P＜0.05),阳性对照组仅存的1只C57BL/6J小鼠的原虫血症为25.410％.结论 P.y和P.b子孢子均能感染大鼠并完成肝期发育进入红内期.鼠疟原虫不易感染大鼠的影响因素在红内期,大鼠体内鼠疟原虫可被清除;P.y对宿主种属表现出更强的选择性;P.b感染大鼠的急性期原虫血症和ECM发生率与小鼠差异均无统计学意义.适应性免疫在大鼠彻底清除体内鼠疟原虫中发挥重要作用.

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)在疟原虫感染过程中表达谱变化特征.方法 建立P.y17XL感染BALB/c鼠疟模型,计数红细胞感染率,记录生存率;使用RNA-seq方法确认P.y17XL感染的BALB/c小鼠lncRNA的差异表达谱.GO和KEGG分析以阐明lncRNAs在疟疾感染过程中对免疫功能的调节作用.结果 与正常对照组小鼠相比,P.y17XL感染BALB/c小鼠脾脏中lncRNAs表达谱发生明显改变,132个lncRNAs表达上调,159个lncRNAs表达下调.通过GO和KEGG分析发现,明显差异表达的lncRNAs包括3个已知和9个新发现的优势lncRNAs,即ENS-MUST00000146154.1、ENSMUST00000181191.1、ENSMUST00000202081.1、LNC_000258、LNC_000871、LNC_000962、LNC_002093、LNC_004354、LNC_006284、LNC_004518、LNC_004350 和 LNC_003730 均与疟疾免疫应答密切相关.结论 P.y 17XL感染改变了宿主lncRNAs的表达谱,宿主-寄生虫相互作用通过lncRNAs调控了抗疟疾免疫应答.本研究为进一步研究疟原虫与宿主细胞之间作用机制提供理论依据.

目的 利用全基因组扫描方法,对BALB/c和DBA2小鼠基因组中疟原虫P.yoelii17XL(P.y17XL)易感位点进行染色体定位.方法 以雌性BALB/c小鼠与雄性DBA2小鼠杂交建立杂交一代小鼠(C.DF1),以雄性C.DF1小鼠与雌性BALB/c小鼠回交,得到回交小鼠(C.DN2).提取129只雌性C.DN2小鼠基因组DNA.利用扩增片段长度多态性确定每只小鼠分布于全基因组的微卫星遗传标记基因型;同时监测小鼠感染P.yoelii17XL后的原虫血症水平.采用基因定位专用软件(MAPMANAGER)进行数量性状位点(QTL)分析.结果 BALB/c小鼠感染P.y17XL后,原虫血症水平迅速攀升,于第6~7d全部死亡;DBA2小鼠感染后原虫血症水平上升缓慢,第10d的生存率为75.00%;C.DF1小鼠的原虫血症水平与DBA2相近,生存率为100.00%.对C.DN2小鼠基因组中的控制感染后原虫血症水平的QTL进行的连锁分析显示,控制感染后第3、4、5 d原虫血症水平的QTL均与小鼠第3号染色体66.69cM处遗传标记D3Mit258连锁.此外,控制原虫血症水平的QTL还与第3号染色体的D3Mit307(19.01cM)、D3Mit278(32.59cM)、D3Mit75(43.73cM)以及第15号染色体的D15Mit90(30.86cM)形成有统计学意义的连锁.当C.DN2小鼠D3Mit278、D3Mit75、D3Mit258和D15Mit90位点为纯合的BALB/c来源的等位基因时,感染P.y17XL后的原虫血症水平低于以上位点基因型为杂合的小鼠;在D3Mit258基因型相同的小鼠中,D15Mit90位点为纯合的BALB/c来源的等位基因时,感染P.y17XL后的原虫血症水平低于以上位点基因型为杂合的小鼠.结论 控制C.DN2小鼠感染P.y17XL后原虫血症水平的QTLs与遗传标记D3Mit307、D3Mit278、D3Mit75、D3Mit258、D15Mit90连锁.BALB/c小鼠来源的与D3Mit278、D3Mit75、D3Mit258和D15Mit90连锁的QTLs对P.y17XL的感染起抵抗作用.

伯氏疟原虫、约氏疟原虫和夏氏疟原虫是3种常见的鼠疟原虫,在疟疾疫苗研究中具有重要地位.环子孢子蛋白(CSP)、裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)和顶端膜抗原1(AMA1)等抗原是几种有效的鼠疟原虫疫苗候选分子,本文综述了鼠伤寒沙门氏菌、卡介苗、乳酸乳球菌、根癌农杆菌、酵母菌、腺病毒、杆状病毒、牛痘病毒、A型流感病毒、猪细小病毒、刚地弓形虫和豚鼠利什曼原虫等载体介导的鼠疟原虫CSP、MSP-1和AMA1疫苗的研制现状.

为探讨TLR9激动剂对疟疾记忆性T细胞的影响,用非致死型约氏疟原虫感染BALB/c小鼠,感染前2d注射TLR9激动剂CpGl826,90 d后进行二次再感染.薄血膜染色法观察虫血症,流式细胞术检测脾细胞悬液中记忆性和活化性T细胞百分率,双夹心ELISA法检测脾细胞培养上清中细胞因子水平.结果发现,再感染前,TLR9激动剂注射组记忆性T细胞百分率(12.98％)高于对照组(10.16％);再感染后,其再感染发生率(50％)和峰值血症水平(0.64％)均低于对照组(70％和0.82％);而活化性T细胞和IFN-γ水平于再感染后1d即出现了显著升高,分别达到6.62％和372.74 pg/mL,其升高幅度高于对照组(5.04％和216.17 pg/mL).这表明,TLR9激动剂对约氏疟原虫记忆性T细胞的产生和维持有一定促进作用.

目的 探讨miR-106b在疟疾红内期感染后控制疫苗免疫保护性随时间逐渐降低中的作用.方法 C57BL/6小鼠通过尾静脉接种约氏疟原虫P.yoelii 17XNL感染的红细胞,接种小鼠给予氯喹控制红内期感染的发生.接种完成后不同时间点(30 d、90 d、180d)首先检测小鼠免疫保护性,ELISA检测小鼠血清抗红内期疟原虫抗体滴度,qRT-PCR检测血清miR-106b表达情况.然后,通过流式细胞技术检测脾脏B细胞TACI (transmembrane activator and CAML interactor)表达变化.最后通过体外培养B细胞,加入miR-106b mimic后检测B细胞TACI表达变化.结果 免疫后30 d小鼠可产生100％的免疫保护,免疫后90d小鼠在iRBC攻击后第3天均出现感染,而免疫后180d小鼠在iRBC攻击后第2天均出现感染.同时,免疫后180d与30d相比抗体滴度明显下降(P＜0.01),并且小鼠血清中miR-106b的表达也呈现明显的下降趋势.流式细胞分析发现免疫后180 d小鼠脾脏记忆性B细胞(memory B cells,MBCs)表面TACI表达比免疫30d及90 d小鼠均出现明显下降(P＜0.01).体外培养B细胞加入miR-106b mimic后TACI表达增高.结论 疟原虫红内期感染后控制疫苗保护性降低与血清中miR-106b及脾脏MBCs表面TACI表达降低有关,提高miR-106b的浓度可增加MBCs表面TACI的表达.

目的 探讨疟疾红外期全虫疫苗免疫保护性随时间逐渐降低的机制. 方法 取C57BL/6及BALB/c小鼠,经尾静脉分别接种10 000或50 000约氏疟原虫(P.yoelii)17XNL子孢子,3h后给予氯喹控制红内期感染的发生.一部分小鼠于接种后30、90、180d用10 000同种疟原虫子孢子进行攻击检查保护性;另一部分在相同时间点取血,分离淋巴细胞,进行流式抗体染色,检测免疫保护性及其与肝脏淋巴细胞表型间的相互关系. 结果 疟原虫全虫抗原免疫后 30d两种小鼠均可产生100％的免疫保护;免疫后90d,C57BL/6保护性开始下降,180d时保护性将至40％,而BALB/ c小鼠保护性无明显变化.C57BL/6小鼠肝脏CD8+TEM细胞PD-1的表达在免疫后180d显著上升(t=7.369,P＜ 0.01),BALB/c小鼠无明显变化(t=1.368,P＞0.05).C57BL/6小鼠肝脏CD8+TEM细胞PD-1的表达免疫后随时间增加而升高,其中免疫后180d较90d时上升趋势更显著(t=6.175,P＜0.01). 结论 在C57BL/6小鼠,疟原虫红外期全虫疫苗免疫保护性随免疫时间延长逐渐降低与肝脏CD8+T细胞PD-1表达增高有关.