外泌体是由活细胞主动分泌的一种纳米级囊泡，内含蛋白质、核酸等生物活性物质，参与细胞间通讯，在肿瘤微环境调节、免疫识别、炎症反应等众多生理病理过程中发挥重要作用。作为一种运输载体，外泌体广泛存在于生物流体中，但由于其粒径小、内含物丰度低，能否获得高质量的外泌体成为后续研究成败的关键。虽然外泌体分离、纯化和鉴定方法日趋发展，但仍未达到成熟水平。本文就外泌体分离和纯化方法的研究进行综述，并比较不同方法的优缺点、适用范围及应用前景，以期为外泌体研究提供参考。

目的:探讨含有血小板源性生长因子BB(PDGF-BB）的载银介孔二氧化硅纳米颗粒（Ag-MSN）这种新型纳米抗菌材料（P-Ag-MSN）的银离子（Ag +）缓释特点及其对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的细胞毒性和体外抗菌性能。 方法:2016年1月至2018年6月，模板法与共沉淀法结合，精确制备出Ag-MSN,将PDGF-BB加载进入Ag-MSN，利用火焰原子吸收光谱法进行检测Ag +缓释特点；从SD大鼠提取并培养BM- SCs，对CD29、CD45进行流式细胞检测，鉴定BMSCs的纯度，取长势良好的第3代BMSCs，检测P-Ag-MSN的细胞毒性；制备不同浓度的P-Ag-MSN混悬液，检测对骨髓炎常见细菌的体外抗菌效果。数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析, P<0.05表示差异有统计学意义。 结果:P-Ag-MSN中的Ag +逐步释放，6~ 12 h后达到峰值；随后释放的幅度逐步下降，并逐渐稳定在一定的浓度。不同浓度的P-Ag-MSN对大鼠BMSCs在1、3、5、7 d时的相对增殖率均值均在80％以上，细胞毒性评级均为0级或I级，对大鼠BMSCs无明显细胞毒性，差异无统计学意义（ P>0.05）。P-Ag-MSN对于大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠球菌均有杀菌效果，其最小杀菌浓度（MBC）分别为25.0、50.0、50.0 μg/ml，对金黄色葡萄球菌无明显杀菌效果，其MBC为100.0 μg/ml。 结论:新型纳米抗菌材料P-Ag-MSN的细胞毒性小，具有良好的缓释效果，在体外对骨髓炎常见细菌有明显抗菌作用。

目的:分离胰腺癌细胞(PANC-1)和人胰腺导管上皮细胞(HPDE6-C7)细胞培养上清液中的细胞外囊泡，分别比较微小RNA(miRNA，miR)-483-5p在两种细胞及其所分泌的细胞外囊泡中的差异性表达。方法:超速离心法制备去除胎牛血清源性囊泡的完全培养基，细胞计数试剂盒(CCK-8)检测超速离心前(对照组)与超速离心后(实验组)的完全培养基对细胞增殖作用的差异；用去除血清囊泡的完全培养基培养细胞，超速离心方法提取细胞外囊泡，用二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒和纳米颗粒跟踪分析(NTA)检测细胞外囊泡(EVs)的浓度；用透射电镜、NTA、蛋白质印迹法(Western blot)鉴定其是否符合细胞外囊泡特征。定量即时聚合酶链反应(qPCR)检测miR-483-5p在两组细胞及其分泌的细胞外囊泡中的表达。CCK-8增殖实验和qPCR实验的结果采用 t检验分析。 结果:CCK-8增殖实验结果显示48 h和72 h后，HPDE6-C7的实验组与对照组之间差异无统计学意义(0.674±0.036比0.671±0.016， t＝0.315， P48 h>0.05；0.890±0.027比0.925±0.099， t＝0.581， P72 h>0.05)；PANC-1的实验组与对照组之间差异无统计学意义(0.759±0.004比0.761±0.016， t＝0.249， P48 h>0.05；1.114±0.025比1.145±0.014， t＝1.898， P72 h>0.05)；透射电镜：细胞外囊泡呈"茶杯托盘"状、NTA结果：98%PANC-1源性细胞外囊泡的直径为130.0 nm、98%HPDE6-C7源性细胞外囊泡的直径为129.7 nm；Western blot实验显示：细胞外囊泡表现为CD63、TSG101阳性，而GM130为阴性；蛋白浓度测定试剂盒和NTA分析测得PANC-1和HPDE6-C7源性的细胞外囊泡浓度分别为：1.5 g/L、1.510 11颗粒/毫升和1.3 g/L、1.610 11颗粒/毫升；与HPDE6-C7比较，PANC-1中miR-483-5p的表达显著增加(2.820±0.180比1.000±0.006， t＝－17.539， P<0.01)；与HPDE6-C7源性细胞外囊泡比较，PANC-1源性细胞外囊泡中miR-483-5p的表达显著增加(3.503±0.265比1.002±0.084， t＝－15.582， P<0.01)。 结论:超速离心法去除胎牛血清源性囊泡的完全培养基不影响细胞的正常增殖；鉴定结果显示所分离的沉淀符合细胞外囊泡的特征；根据NTA的结果可以判断其应归类于小细胞外囊泡；qPCR结果表明，miR-483-5p在PANC-1和其分泌的细胞外囊泡中均为高表达。

目的:探讨血浆和尿液中细胞外囊泡微小RNA-4639和微小RNA-210在膜性肾病中的表达、疾病监测和预后评估价值。方法:2020年9月至2021年3月期间于苏州大学附属第三医院纳入30例健康和30例膜性肾病患者，聚乙二醇(PEG)沉淀法提取血浆和尿液细胞外囊泡；电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析仪表征形态；蛋白质印迹测定囊泡表面标志物的表达；荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测定微小RNA的表达水平； t检验和皮尔森相关系数分析数据；受试者工作特征曲线评价微小RNAs的诊断效能。 结果:膜性肾病患者尿液细胞外囊泡的浓度及标志物的表达明显高于对照组(4.00×10 11±1.00×10 10颗粒数/毫升比2.80×10 11±1.00×10 10颗粒数/毫升，CD63：0.81±0.20比1.00±0.12，CD81：0.43±0.10比1.00±0.44， t＝14.70，1.46，1.88， F＝1.00、3.52、19.68， P均<0.05)，miR-4639和miR-210在血浆和尿液细胞外囊泡中的水平显著升高(miR-4639：1.62±1.10比0.69±0.33，2.52±0.77比1.66±0.38；miR-210：1.37±0.89比0.68±0.32，2.20±0.85比1.14±0.56， t＝4.45，5.21，4.03，5.33， F＝11.46、4.08、7.74、2.29， P均<0.05)，且分别与肾小球滤过率(eGFR)的下降和尿蛋白的升高显著相关( r＝－0.308、0.355和 r＝－0.473、0.475， P均<0.05)。囊泡内miR-4639和miR-210表达在肾功能受损个体(eGFR<90 ml/min·1.73 m 2)和严重蛋白尿的个体(≥3.5 g/24 h)中均显著高于对照组(miR-4639：1.81±1.45比1.00±0.68，2.59±0.72比1.76±0.53；miR-210：1.80±1.19比0.83±0.44，2.31±0.86比1.24±0.64， t＝2.93、4.54、4.60、4.93， F＝4.58、1.84、7.36、1.84， P均<0.05)。膜性肾病进展组患者的基线血浆细胞外囊泡miR-4639和miR-210表达量更高(miR-4639：1.91±1.12比0.93±0.48；miR-210：1.34±0.46比0.88±0.41， t＝2.58，2.47， F＝5.54、1.26， P均<0.05)。双miRNAs组合对评估肾功能水平和24 h尿蛋白水平均具有更好的诊断价值(灵敏度75.00%、93.33%，特异度79.17、85.71%，曲线下面积为0.83、0.93)。 结论:细胞外囊泡miR-4639和miR-210可作为有效生物标志物，以协助膜性肾病的诊断，评估其严重程度和疾病进展。

目的:研究纳米二氧化钛颗粒（TiO 2-NPs）职业暴露人群血清代谢谱变化，探索TiO 2-NPs健康效应的生物标志物和损伤机制。 方法:于2020年6月至2021年6月，通过典型抽样的方法选取某TiO 2-NPs生产企业职工为研究对象，从企业中选取接触TiO 2-NPs工人64人为暴露组，选取同企业后勤行政人员62人为对照组，使用非抗凝采血管收集血样。样品经甲醇沉淀蛋白后采用超高效液相色谱飞行时间质谱技术采集非靶向代谢组学数据，筛选生物标志物并进行代谢通路分析。 结果:通过 P<0.05和变量重要性投影指标（ VIP）值>1两个指标筛选出46个差异代谢物，主要包括甘油酯类、鞘磷脂类、甘油磷脂类、脂肪酰基类等；通过受试者工作曲线（ROC）分析确定3-羟基-4，5-二甲基-2（5H）-呋喃酮、4-氨基联苯、庚酰肉碱、十六烷二酸单-L-肉碱酯、伊布利特、LysoPA[18∶1（9Z）/0∶0]、LysoPC（18∶0）、PC（16∶0/16∶0）、PC[16∶0/20∶4（5Z，8Z，11Z，14Z）]、PC[P-18∶1（9Z）/P-18∶1（9Z）]10个候选生物标志物；涉及4条代谢通路的变化，分别为甘油磷脂代谢，鞘脂代谢，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，亚油酸代谢。 结论:TiO 2-NPs职业暴露会对血清代谢谱产生明显影响。

目的:从外泌体分离的常用方法中探索获取高质量人滑膜成纤维细胞外泌体的有效方法。方法:分别用超速离心法、尺寸排阻法和改良的聚合物沉淀法3种方法提取人滑膜成纤维细胞外泌体，采用透射电镜、蛋白质印迹法（Western Blot）、纳米颗粒追踪分析（NTA）鉴定并比较外泌体的形态特征、粒径分布、浓度以及标志蛋白的表达水平。3组差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验，以 P<0.05表示差异具有统计学意义。 结果:3种方法均能成功提取得到外泌体，透射电镜下均能观察到典型的"茶托状"结构，蛋白质印迹法均能检测到标志蛋白肿瘤易感基因101（TSG101）、多配体聚糖结合蛋白1（Syntenin-1）、CD63的表达，粒径主峰均符合30~150 nm范围。外泌体纯度方面：超速离心法杂质最少，尺寸排阻法杂质中等，而改良的聚合物沉淀法可观察到大量的聚合物颗粒和蛋白杂质。外泌体得率方面：3种方法得到的外泌体颗粒浓度差异有统计学意义（ F=9.61， P=0.049），改良的聚合物沉淀法得到的外泌体颗粒浓度高于超速离心法[（98.0±17.0）×10 10个/ml和（11.6±7.7）×10 10个/ml， t=-4.34， P=0.023]。 结论:RA滑膜成纤维细胞来源的外泌体不难获取，3种方法均有效，然而改良聚合物沉淀法得到的外泌体杂质较多，可能不利于下游分析不推荐使用；超速离心法得到的外泌体纯度高，但操作繁琐，且损耗较大，适合大体积样本和对纯度要求高的研究；尺寸排阻法得到的外泌体纯度和颗粒浓度均较高，适合小体积样本。

随着疾病早期诊断及生物标志物开发、功能界定等需求的出现，免疫检测技术的灵敏度不足这一问题日益显著，如何提高检测灵敏度去突破瓶颈成为现在生物分析领域的一个重大挑战。对检测信号进行放大是提高检测灵敏度最直接的一种方法。生物素-亲和素系统(biotin-avidin system, BAS)、酪胺信号放大技术(tyramide signal amplification, TSA)以及免疫-聚合酶链反应(immuno-polymerase chain reaction, Im-PCR)是较为经典的信号放大技术，可显著提高免疫检测的灵敏度。近年来，研究发现，基于催化信号分子沉淀的信号放大技术、基于纳米颗粒的信号放大技术及基于杂交链式反应的信号放大技术等信号放大手段的出现，使得免疫检测的灵敏度可以进一步提高3个数量级。本文将针对近年来研究较多的几种用于免疫检测信号放大的技术进行总结，并对其优缺点进行比较分析，以期为已开发的信号放大技术向临床转化及进一步开发超高灵敏度的免疫学检测技术提供参考。

目的:建立铁蛋白-普鲁士蓝纳米材料（ferritin-PB NPs）的制备方法，并探究其光热转换性能和对肿瘤细胞的光热杀伤效果。方法:首先通过沉淀法制备普鲁士蓝纳米材料（PB NPs），随后负载于铁蛋白空腔结构中，构建得到ferritin-PB NPs。采用红外光谱和紫外可见分光光谱测试ferritin-PB NPs中的成分组成，采用动态光散射仪和透射电子显微镜测试ferritin-PB NPs的尺寸及形貌，通过热成像仪测试ferritin-PB NPs的光热升温效果及光热稳定性效果，通过激光共聚焦显微镜观察ferritin-PB NPs在HeLa细胞和HepG2细胞中的摄取效果，并通过MTT实验测试ferritin-PB NPs对HeLa细胞的光热杀伤效果。结果:ferritin-PB NPs的形貌为铁蛋白内部包覆PB NPs的复合结构，可响应730 nm激光辐照迅速将光能转化为热能，导致测试溶液温度明显升高。ferritin-PB NPs能迅速被HeLa细胞和HepG2细胞摄取，并且在730 nm光照条件下抑制HeLa细胞的增殖。结论:通过简便的方法制备了ferritin-PB NPs，具有良好的生物相容性和光热细胞毒性效果，后期有望用于体内肿瘤治疗。

目的 探讨在间充质干细胞上清液中分离纯化小细胞外囊泡的优化方法.方法 对比差速离心[differential(ultra)centrifugation,dUC]、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀和QIAGEN试剂盒法3种标准细胞外囊泡分离程序,并基于标准程序分别进行超滤浓缩、0.22μm滤膜过滤或0.45 μm滤膜过滤改良方案提取小细胞外囊泡,通过比较各分离方法的操作时长和简易程度,并分别用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析技术(nanoparticle tracking analysis,NTA)和Western blot评估小细胞外囊泡的形态结构、粒径分布和标志蛋白表达情况,分析各分离方法提取的小细胞外囊泡质量和效率.采用CCK-8实验和Transwell迁移实验评估改良方法提取的小细胞外囊泡对乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响.结果 dUC法、PEG沉淀法和QIAGEN试剂盒法3种分离方法均可分离出小细胞外囊泡,其中QIAGEN试剂盒法操作时长最短,平均为48 min,添加超滤浓缩步骤后延长至93 min(P＜0.0001).PEG沉淀法的操作时间最长,平均为487 min,添加超滤浓缩步骤后延长至547 min(P＜0.0001).dUC法平均操作时间为217 min,添加超滤浓缩步骤后延长至274 min(P＜0.0001).各样本在透射电镜下均观察到典型的"茶托"样结构,粒径分布范围除QIAGEN试剂盒法在200 nm以上,其余均在30-200 nm之间,其中dUC+0.45 μm滤膜过滤组一个视野中观察到的小细胞外囊泡典型结构最多且最完整.Western blot检测结果显示各方法提取的样本中均有阳性标志蛋白CD9、CD63、TSG101表达,不表达阴性标志物calnexin,但0.22 μm滤膜过滤后,各方法的小细胞外囊泡标志蛋白条带均变浅.NTA结果显示,dUC+0.45 μm滤膜过滤的小细胞外囊泡占比最高,达94.86％.不同方法提取的样本的粒径分布图显示,dUC法标准流程和dUC+0.45μm滤膜过滤组的NTA结果显示为单峰,曲线流畅.取dUC+0.45 μm滤膜过滤的样本进行乳腺癌细胞表型实验,结果显示,细胞增殖和迁移能力均增强(均P＜0.05).结论 dUC法是一种有效的间充质干细胞小细胞外囊泡分离方法,在进行超速离心前对细胞上清液进行0.45μm滤膜过滤,可以提高小细胞外囊泡的质量.

目的 制备白藜芦醇(RES)纳米混悬剂,并进行体外评价.方法 采用沉淀法制备RES纳米混悬剂.以平均粒径及多分散系数(PDI)为评价指标,正交试验优化制剂工艺.冷冻干燥法制备纳米混悬剂冻干粉末并进行表征.使用透析袋法研究制剂的体外释放情况.建立高糖刺激的ARPE-19细胞损伤模型,CCK-8法评估RES纳米混悬剂对细胞活力的影响.结果 RES最优处方工艺为:RES浓度6 mg/mL,两种稳定剂(PVP K17∶HPMC)质量比2∶1,RES与稳定剂质量比1∶2,5％甘露醇做冻干保护剂.RES纳米混悬剂为相对规则的颗粒状,载药量为28.04％,36 h内累计释放量达91.27％.与RES相比,RES纳米混悬剂预处理后ARPE-19细胞活力显著提高(P＜0.05).结论 RES纳米混悬剂可提高RES的体外释放率,并且能够减轻高糖对ARPE-19细胞的损伤,提高细胞存活率.