纽莫康定B0是棘白菌素类化合物,其半合成衍生物卡泊芬净已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗无效或无法耐受其他抗真菌药的患者的侵袭性曲霉病.然而,通过发酵产生的纽莫康定B0的效价较低,限制了卡泊芬净的工业生产.本研究将优化好的的培养基进行了改良,添加了4种前体物质.研究结果表明,大豆油、亮氨酸、异丁醇和甲硫氨酸显著影响发酵单位;进一步的正交试验结果表明,大豆油(A)对纽莫康定B0效价的影响极显著(P＜0.05),亮氨酸(B)、异丁醇(C)和甲硫氨酸(D)影响次之,最优发酵条件为A2B2C3D2即大豆油6.0g/L,亮氨酸1.0g/L,异丁醇4.0ml/L,甲硫氨酸0.3g/L时,纽莫康定B0发酵单位达到1295mg/L左右.此外,还应用正交试验验证各因素的显着性.当将kLa作为指导参数,使用A315型叶轮的100L发酵罐进行放大和工业规模生产时,与原始效价相比,纽莫康定B0产量增加了361％,并达到了2250mg/mL的水平.

纽莫康定B0(pneumocandin B0,PB0)是由丝状真菌Filamentous fungus产生的次级代谢产物,可用于合成抗真菌药物卡泊芬净.为提高PB0的产量,对丝状真菌SIPI 2776菌株进行亚硝基胍(NTG)、60Co伽马射线(60Co-y)、紫外(UV)和常压室温等离子体(ARTP)等诱变,获得突变菌株11-γ-12,PB0摇瓶产量为1.48g/L.此外,利用基因工程改造技术得到纽莫康定C0(PC0)含量降低的工程菌株F-ap-htyE.使用响应面法优化发酵培养基,使PB0摇瓶产量达到2.01 g/L,并研究了发酵罐的分批补料培养,通过优化甘露醇的补加量,使PB0发酵产量达到2.71g/L.

抗真菌药物卡泊芬净是以丝状真菌Zalerion arboricola的菌体代谢产物纽莫康定B0为中间体经化学合成得到.该菌在代谢产纽莫康定B0的同时还会产生多种具有相似结构的代谢物.为了从这些结构类似物中寻找潜在的抗真菌药物中间体,对Zalerion arboricola菌株HCCB30111的代谢产物进行了分离纯化和结构鉴定.本实验成功的从该菌株的发酵液中分离到一个化合物,经结构鉴定证明其为纽莫康定B0的结构类似物.该发现为进一步质量研究,结构修饰和抗真菌活性物质的筛选工作奠定了基础.

目的 从Zalerion arboricola菌体发酵液制备的纽莫康定B0粗品中,分离纯化纽莫康定B0丝氨酸类似物,并鉴定其化学结构.方法 首先用PSN色谱填料进行富集;随后用X,和C18色谱填料进行分离、纯化,得到样品后用质谱、核磁进行检测,并对检测数据进行汇总、分析,鉴定该目标化合物的化学结构.结果 经过分离、纯化得到目标化合物样品,进行结构鉴定后确定该化合物为纽莫康定B0丝氨酸类似物,与文献报道的结构一致.结论 分离、纯化得到的纽莫康定B0丝氨酸类似物,为进行发酵及纯化工艺优化、质量研究,以及进行结构修饰,筛选活性物质奠定了基础.

建立了HPLC法测定纽莫康定B0(1)残留.色谱柱采用Waters XBridge(R) Amide柱(4.6 mm×250 mm,3.5 μm),流动相为0.1％磷酸水溶液∶乙腈(13∶87),等度洗脱,检测波长为195 nm,柱温为40℃,流速为0.6 ml/min,进样量为20μl.结果 显示,1在0.0150～1.2614 μg/ml内线性关系良好,r=0.9995.检测限为0.092 ng,定量限为0.3 ng.棉签回收率(n=6)、方法回收率(n=9)、316L型不锈钢擦拭取样回收率(n=6)、316L型不锈钢淋洗取样回收率(n=6)分别为98.0％、99.3％、88.6％和98.1％,RSD分别为0.79％、1.26％、2.30％和1.33％.本法准确、简便、重复性好,可用于测定设备清洁后1的残留.

[背景]肠道沙门氏菌(Salmoella enterica)是一种常见的食源性肠道致病菌,可以感染人畜并引发食物中毒、伤寒等疾病.近年来因抗生素滥用导致肠道沙门氏菌耐药性问题日益严峻,迫切需要开发新型抗感染药物.肠道沙门氏菌致病的关键在于与宿主细胞接触后可以通过Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS)向宿主细胞内注射效应蛋白,进而调控宿主细胞囊泡运输和免疫应答等生理活动,以方便其高效侵染宿主细胞.T3SS是一类由超过20种蛋白质组成、高度复杂的跨膜分子机器,是革兰氏阴性病原菌中普遍存在的一类蛋白质运输系统和毒力系统.在不同病原菌中,其结构与功能非常保守.位于T3SS核心跨膜区的SctV家族蛋白是T3SS中最保守的组分之一,参与T3SS能量供应和效应蛋白的分泌过程,SctV蛋白的关键氨基酸突变失活后会导致鼠伤寒沙门氏菌丧失对宿主的入侵能力.[目的]以沙门氏菌SctV家族蛋白为靶点,尝试通过虚拟筛选技术筛选与SctV胞内区相互作用的抗感染类T3SS抑制剂.[方法]结合体外相互作用分析、细菌生长曲线实验、细菌分泌实验和细胞侵染实验等对候选分子进行抑制效果的分析和验证.[结果]最终筛选出小分子抑制剂C4(纽莫康定B0)和C5(茜草素),二者均可以显著抑制T3SS分泌效应蛋白,并进一步抑制鼠伤寒沙门氏菌对NCM460细胞的侵染.进一步的研究发现,化合物C4和C5并不是通过结合到SctV胞内区而是通过其他不同机制来抑制细菌的毒性.[结论]化合物C4通过未知通路调控T3SS效应蛋白的分泌过程,而C5可能通过下调调控基因hilD的表达来抑制T3SS分泌效应蛋白,并进一步抑制沙门氏菌对NCM460细胞的侵染.本研究为针对T3SS开发新型抗感染药物提供了新的靶点和思路,并为后续T3SS抗感染类抑制剂的优化和改造提供了分子理论基础.