目的:利用毕赤酵母高效表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域(receptor binding domain，RBD)，并评估以该RBD蛋白作为抗原所制备的疫苗组合物的免疫原性。方法:选取RBD蛋白并合成对应基因片段，将其构建至pPICZαA质粒，质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达。Western blot和基于BLI(Biolayer Interferometry)技术的定量分析方法对培养上清中RBD蛋白进行检测，筛选能够分泌表达RBD蛋白的单克隆菌株。通过优化发酵工艺，包括培养基的盐浓度调整和诱导条件优化(pH、温度和时间等参数)，实现RBD蛋白的高效表达，并在小鼠体内评估其免疫原性。结果:筛选获得重组RBD蛋白表达效果较好的RBD-X33单克隆菌株。通过优化后的发酵工艺，即采用HBSM培养基、诱导pH为6.5±0.3、诱导温度为22℃、诱导时间持续120 h，实现发酵收获上清中重组RBD的表达量达到240 mg/L。在小鼠免疫原性试验中，采用铝+CpG双佐剂系统吸附重组RBD蛋白的疫苗组合物能够激发小鼠产生2.7×10 6结合抗体滴度和726.8活病毒(野生型)中和抗体滴度。 结论:采用毕赤酵母表达系统能够高效表达重组RBD蛋白，且所表达的RBD蛋白能够有效激发动物产生免疫应答。本研究为基于RBD蛋白的重组新型冠状病毒疫苗的开发提供了参考。

为了优化猪肉中沙门菌定量检测方法，并对成都市部分农贸市场零售的猪肉样品中沙门菌污染浓度进行定量研究。本研究于2020年基于我国沙门菌定性检测方法（GB4789.4-2016）和美国农业部食品安全检验局（Food Safety and Inspection Service，FSIS）定量检测方法（MLG 4.08和MLG Appendix 2.05 MPN），使用成都地区市售70份肉猪样品对沙门菌定量检测中选择性增菌液、筛选平板、鉴定方式以及定量稀释比例进行优化，通过 t检验分析获得适用的优化方法，使用优化方法对2020年6—10月成都市部分农贸市场采集的40份零售猪肉样品进行沙门菌定量检测。结果显示，对于生鲜猪肉样本，TTB增菌液筛选沙门菌符合度显著高于RV增菌液（0.93±0.32 vs 0.35±0.62， t=8.324， P =0.001），XLT4平板筛选到的可疑菌落符合度显著高于沙门显色培养基（0.77±0.09 vs 1.00±0.00， t=2.971， P =0.017）。使用4个连续梯度稀释的12管MPN法，可获得准确的沙门菌污染浓度数值。经选择性增菌液TTB增菌后划线于XLT4平板，并使用荧光PCR联合MALDI-TOF微生物质谱鉴定，可实现猪肉样品中沙门菌高效分离鉴定。部分农贸市场零售生鲜猪肉中沙门菌的检出率为92.5%（37/40），大部分阳性样品（83.8%，31/37）沙门菌的污染水平在0.1~55 MPN/g范围。本研究优化的沙门菌定量检测方法，可有效对猪肉中沙门菌污染进行定量分析。

目的:以葛根淀粉和硝酸银为反应原料,制备葛根纳米银材料,考察其特征及对多花黄精种子萌发的影响.方法:通过微波加热合成纳米银水溶胶,并采用UV-Vis、TEM、FTIR、XRD和EDS对性能进行表征,在MS培养基中添加纳米银,研究不同浓度纳米银对多花黄精种子萌发的影响.结果:采用100 mL小烧杯(葛根淀粉液50 mL)的单因子优化实验表明,适宜的条件为:AgNO3浓度4.0 g/L、APG溶液0.4 mL、NaCl浓度0.04 g/L、pH值13、微波加热40 s.根据单因子优化条件,采用1 L大烧杯(葛根淀粉液500 mL)放大制备试验,得到的纳米银水溶胶在396.7 nm处出现特征吸收峰,纳米银颗粒为类球形,结晶度较高,含有C、O和Ag元素.在MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基中加入终浓度为5 mg/L的纳米银,选择沙藏50 d、GA3 100 mg/L处理24 h的多花黄精种子接种在上述培养基中,与未添加纳米银的对照相比,种子开始萌发时间大大缩短,萌发率显著提高,达79.6％,根茎芽浓绿,根系发达.结论:以葛根淀粉和硝酸银为原料成功制备了类球形、粒径小、结晶度高的纳米银材料;在培养基中加入该纳米银5 mg/L时,能促进多花黄精种子的萌发.

目的 采用Plackett-Burman实验和响应面法(response surface methodology,RSM)优化酵母源无血清培养基(serum-free medium,SFM)的营养组分,明确培养基成分及浓度.方法 以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为研究对象,在实验室前期筛选出的SFM的基础上,采用Plackett-Burman实验对10种营养组分进行筛选.筛选出对细胞具有促生长作用的因素后,利用RSM进行二次优化,以阐明各变量间的相互作用,确定促CHO细胞生长的最佳培养基组成.取对数生长期CHO细胞,用优化后的培养基重悬后,进行传代扩增.结果 经Plackett-Burman实验筛选的10个变量中,酵母抽提物(yeast extract,YE)FM888和微量元素能有效提高细胞比生长速率;非必需氨基酸和FM888对提高细胞存活天数作用显著;FM888、必需氨基酸、非必需氨基酸及微量元素能显著提高活细胞密度.综合选择FM888、微量元素和非必需氨基酸3个因素进行RSM优化试验.优化后的培养基悬浮培养CHO细胞时,其最大比生长速率可达0.025/h,存活天数可达6 d,最大活细胞密度可达7.187 × 106个/mL.将优化后的培养基进行细胞稳定传代试验,可稳定传代12代,其活细胞密度及细胞活率与对照组(商业化SFM)接近.结论 成功获得成分明确且能支持CHO细胞高密度生长的酵母源SFM,为YE在动物细胞培养中的应用以及高效SFM的开发提供了参考和依据.

目的:建立通过小分子化合物将大鼠胚胎成纤维细胞(REF)重编程为化学诱导神经元(ciNC)的方法体系,为细胞移植治疗神经退行性疾病提供安全有效的供体细胞.方法:以裴钢研究团队建立的人成纤维细胞直接重编程为神经元的方法为基础,通过更换包被液、缓解氧化应激损伤、添加神经源性保护因子、调整毛喉素浓度和小分子去除实验对诱导培养基和成熟培养基进行优化,并通过免疫荧光法和蛋白质印迹法验证不同诱导阶段细胞的相关蛋白质.结果:以原方案进行诱导时,细胞存活率仅(34.24±2.77)%.包被液更换为基质胶后,细胞存活率上升到(45.41±4.27)%;添加褪黑素后细胞存活率提高至(67.95±5.61)%,(23.43±1.42)%的细胞转变为神经样细胞;添加小分子P7C3-A20后细胞存活率进一步提升至(76.27±1.41)%,(39.72±4.75)%的细胞转变为神经样细胞;毛喉素浓度提升至30 μmol/L时,神经样细胞比例达到(55.79±1.90)%;去除SP600125后,(86.96±2.15)%细胞存活,神经样细胞生成率提高至(63.43±1.60)%.以优化后的方案诱导,可经过神经前体细胞将REF诱导为ciNC.其中,神经前体细胞能够高表达神经前体细胞标志物SRY-box转录因子2、配对盒6以及神经元特异性标志物Ⅲ类β-微管蛋白,而成纤维相关蛋白波形蛋白表达量减少.神经前体细胞在成熟培养基中诱导两周后,可见大部分细胞呈神经样细胞形态,诱导后的ciNC高表达Ⅲ类β-微管蛋白和微管相关蛋白2,而成纤维相关蛋白波形蛋白表达减少.结论:优化后的小分子组合在常氧条件下能将REF重编程为ciNC.

背景与目的:嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T,CAR-T)细胞疗法对血液和淋巴系统肿瘤的治疗效果显著,但对实体瘤效果较差,这与靶点选择的因素有关.针对尤因肉瘤(Ewing sarcoma,ES),CD99可作为CAR-T细胞潜在的靶点.由于T细胞自身表达CD99蛋白,靶向CD99的CAR-T细胞存在体外扩增能力有限的问题.本研究旨在通过增加CD99敲低的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)、优化慢病毒转导的感染复数(multiplicity of infection,MOI)、筛选培养CAR-T细胞的培养基及培养容器,以获得CD99 CAR-T细胞制备的最优条件.方法:筛选shRNA序列,提高CD99 CAR-T细胞的扩增能力.采用不同的MOI、培养基和培养容器,分别检测在不同条件下CAR-T细胞的转导效率、细胞存活率、增殖能力、特异性杀伤能力及干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)释放水平等,筛选出最优的细胞制备条件.结果:通过shRNA敲低得到的KO-CD99 CAR-T细胞扩增水平显著高于CD99 CAR-T细胞[(16.40±0.40)vs(6.33±1.53),P＜0.01].转导MOI为0.25～1.0、培养基为OptiVitro时细胞的扩增效果最优.在透气瓶中培养的CAR-T细胞扩增倍数显著高于在培养袋中培养的细胞[MOI=0.25:(50.23±3.32)vs(13.02±4.82);MOI=0.50:(49.96±0.83)vs(18.25±2.88);MOI=1.00:(48.27±5.08)vs(13.16±6.26);P＜0.01],且细胞分型更优、特异性杀伤更高.结论:通过shRNA技术得到的KO-CD99 CAR-T细胞可实现稳定扩增.从扩增条件优化结果看,MOI为0.25～1.00,培养基为OptiVitro,培养容器为透气瓶的条件下,KO-CD99 CAR-T细胞可获得更优的扩增能力、更多比例的记忆T细胞,为后续开展CD99 CAR-T细胞治疗ES的临床试验奠定了坚实基础.

目的 探究并优化新生小鼠大脑皮质星形胶质细胞体外原代培养方法,为星形胶质细胞的体外培养提供更优解.方法 为优化小鼠大脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,取新生3 d的C57BL/6J小鼠大脑皮质组织,去除脑膜和血管,经胰酶消化后离心,加入高糖的杜氏改良Eagle培养基(DMEM)吹打形成细胞悬液.进一步通过差速贴壁法、十字交叉手摇法以及恒温振摇法进行纯化,将细胞分别以不同培养密度接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶中,并通过形态学观察,免疫荧光染色等方法对星形胶质细胞进行纯度鉴定.结果 新生小鼠大脑皮质细胞以5×106个/瓶密度接种效果好,活性高;纯化过程中使用高糖DMEM培养基联合差速贴壁法、十字交叉手摇法及恒温振摇法,星形胶质细胞纯度可达99％.结论 成功建立并优化小鼠大脑皮质星形胶质细胞的原代培养方法.

实验选取绿潮藻提取物和铜藻提取物作为一种高经济价值藻——杜氏盐藻生长的营养添加剂,与传统的f/2培养基相比,探究两种大型海藻提取物对杜氏盐藻的生长和某些代谢活性(色素、碳水化合物、蛋白质、光合活性)的影响.藻类生理指标和营养成分分析表明,不同浓度的藻华提取物对杜氏盐藻生长的促进效果显著.添加0.26％、0.31％、0.38％的绿潮藻提取物和添加0.24％的铜藻提取物均能够显著促进杜氏盐藻生物量增长、光合色素和营养物质的积累,但对杜氏盐藻的最大光化学效率(Fv/Fm)和有效量子产量(Yield)无显著影响.研究表明,一定浓度的绿潮藻提取物和铜藻提取物能够显著促进杜氏盐藻的生长和营养物质的积累,该发现为藻华防控及利用大型藻华提取物来优化杜氏盐藻的生产提供了新的思路.

目的:构建可在体外稳定培养和传代的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)并鉴定其生物学特征.方法:取人乳腺浸润性导管癌组织,采用酶解-组织块培养法和差速贴壁法分离纯化CAFs,用免疫荧光检测α-肌动蛋白、血小板源性生长因子受体β和广谱细胞角蛋白;采用人端粒酶表达慢病毒感染CAFs使其永生化;在商品化FGM-2(fibroblast growth medium-2)培养基的基础上添加谷氨酰胺、非必需氨基酸和抗坏血酸以优化培养条件,在体外连续培养传代,并用β-半乳糖苷酶染色鉴定各代细胞中衰老细胞的比例.对构建成功的CAF1、CAF2和CAF3细胞系进行高通量RNA测序,分析差异表达基因(DEGs)及其相关信号通路;基于3个CAF细胞系CAF亚型标志基因的表达水平,鉴定其生物学特征.结果:成功分离原代CAFs,并构建3株永生化CAF细胞系;成功优化了 CAFs的培养条件,使CAF细胞系在体外培养时不易发生细胞衰老表型(t=2.972、7.049,均P＜0.05);RNA测序结果分析显示,CAF1与CAF2有3 150个DEGs,CAF2与CAF3有3 544个DEGs;而CAF1与CAF3有343个DEGs.对DEGs进行GO富集分析(gene ontology enrichment analysis)表明,CAF2高表达基因主要参与蛋白水解、细胞外基质重塑、血管生成和细胞黏附等信号通路;CAF1和CAF3高表达基因主要参与细胞分裂、细胞周期、DNA损伤修复和有丝分裂等信号通路.对3个CAF细胞系亚型特征性分析表明,CAF1和CAF 3具有炎性CAFs特征,CAF2具有基质型CAFs特征.结论:成功构建得到3株可在体外稳定传代且具有不同生物学特征的CAF细胞系,为CAFs在乳腺癌发生和进展中作用机制的研究提供了可靠的细胞模型.

目的 优化食管鳞癌类器官的培养方法.方法 收集郑州大学第二附属医院胸外科2023年5月至2024年3月食管鳞癌手术标本20例,用含/不含R-spondin 1的培养基培养类器官,观察二者对类器官生长的影响,同时比较市售的0.25％Trypsin-EDTA、1×Tryple和自配的组织消化液对类器官的消化效果.结果 用含/不含R-spondin 1培养基培养食管鳞癌类器官时,两者的类器官大小、生长速率无明显差别(P＞0.05).0.25％Trypsin-EDTA消化细胞球时,细胞分散状态好,所生成的细胞球的数量均多于组织消化液和1×Tryple,1×Tryple消化细胞球的效率和所生成的细胞球的数量均大于组织消化液.结论 R-spondin 1对食管鳞癌类器官的形成无明显影响;类器官传代扩增时,用0.25％Trypsin-EDTA有较好的消化效果.