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基于全基因组测序的我国耐多药结核分枝杆菌耐药突变特征分析
编辑人员丨1周前
目的:利用全基因组测序数据分析中国耐多药结核分枝杆菌的耐药相关基因突变谱及主要突变类型与菌株基因型的相关性。方法:查询并下载NCBI数据库中截至2019年8月公开发表的中国结核分枝杆菌全基因组测序数据,利用全基因组数据预测菌株分子药敏结果,统计不同药物耐药相关基因的突变类型,并分析耐药突变类型与菌株基因型的相关性。结果:根据分子药敏结果从2 019株菌株中鉴定出1 024株耐多药菌株,对常用抗结核药物的耐药相关基因主要突变类型分别为 katG S315T(73.2%,异烟肼)、 rpoB S450L(63.1%,利福平)、 rpsL K43R(70.0%,链霉素)、 embB M306V(37.4%,乙胺丁醇)、 pncA启动子区T(-11)C(7.9%,吡嗪酰胺)、 gyrA A90V (32.3%,氟喹诺酮类)、 rrs A1401G(67.7%,二线注射类)、 fabG1启动子区C(-15)T(87.0%,乙硫异烟胺)、 folC I43T(30.4%,对氨基水杨酸)。其中, katG S315T、 rpsL K43R、 embB M306V、 gyrA D94G在L2系菌株中的频率显著高于L4系菌株, folC I43T仅在L2系菌株中发现; katG S315T在古典北京型菌株中比例较高,而 rpsL K43R在现代北京基因型菌株中的比例更高,其差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:本研究提供了基于全基因组测序的我国耐多药结核分枝杆菌对多种常用抗结核药的耐药相关基因主要突变类型,为研发敏感、特异的快速分子检测方法提供了依据;同时也发现多种耐药相关基因主要突变类型与菌株基因型有关。
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编辑人员丨1周前
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新型分枝杆菌荧光报告噬菌体的构建及其在结核分枝杆菌药敏检测中的应用
编辑人员丨1周前
目的:设计基于纳米荧光素酶(Nluc)的新型荧光报告系统,构建新型分枝杆菌荧光报告噬菌体ΦFN,分析该噬菌体检测结核分枝杆菌耐药性的能力。方法:构建P furAma启动子控制表达的Nluc荧光报告系统,将其整合至耻垢分枝杆菌基因组中,测试其在分枝杆菌的荧光报告能力;随后将P furAma- nluc报告系统整合到TM4分枝杆菌噬菌体基因组中,构建新型分枝杆菌荧光报告噬菌体ΦFN;通过调整药物预处理时间、感染时间等条件,建立ΦFN检测分枝杆菌耐药性的快速检测流程,在96孔板中检测52株已知耐药性的结核分枝杆菌临床分离株对3种一线抗结核药物耐药的耐药性。 结果:整合型表达荧光报告系统P furAma- nluc的耻垢分枝杆菌可报告下限达到100菌落形成单位(colony-forming unit,CFU),低于已报道的P left启动子表达 nluc系统。新型分枝杆菌荧光报告噬菌体ΦFN可通过孔板读值法在24 h内检测到分枝杆菌的存在,检测下限达到100 CFU。药物与待测菌预培养48 h后再加入噬菌体孵育24 h,敏感菌在10 5 CFU以下均无法检测到荧光信号,可有效区分敏感株并进行耐药性的快速检测。以罗氏药敏实验作为金标准,使用ΦFN检测52株结核分枝杆菌临床菌株对利福平、异烟肼和链霉素的耐药性,检测准确性分别是51/52、48/52、49/52。 结论:利用新型重组荧光报告噬菌体检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、链霉素的耐药性具有极高的准确性,报告时间仅需3 d,有望成为一种快速简便的结核分枝杆菌耐药性检测新方法。
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编辑人员丨1周前
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宏基因组二代测序对不同类型结核病的诊断价值
编辑人员丨1周前
目的:研究宏基因组二代测序技术(mNGS)对不同类型结核病的诊断价值。方法:回顾性分析2019年1月1日至12月31日上海市肺科医院收治的行mNGS检测并行结核分枝杆菌(MTB)抗酸染色涂片法、MTB培养法及利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF)检测的疑似结核病患者,研究共纳入疑似结核病205例,男120例,女85例,中位年龄为34 (16, 70)岁。其中结核病165例,男92例,女73例,中位年龄30(12, 67)岁;非结核病40例,其中感染性疾病28例,恶性肿瘤12例,男28例,女12例,中位数年龄45(24, 78)岁。以最终诊断为参考标准,计算mNGS对不同类型的结核病(肺结核与肺外结核)及与不同诊断方法诊断效率的差异, P<0.05为差异有统计学意义。 结果:以临床诊断结果作为参考标准,mNGS诊断结核病的敏感度为60%(99/165,95% CI为0.53~0.67),特异度为100%(40/40,95% CI 为0.90~1.00), 阳性预测值为100%(99/99, 95% CI为0.95~1.00),阴性预测值为38%(40/106,95% CI为0.29~0.48)。mNGS诊断肺结核的敏感度为59% (59/100),显著高于涂片法(15%,15/100)和培养法(26%,26/100), 差异均有统计学意义(均 P<0.001),但与Xpert法(52%,52/100)比较差异无统计学意义( P=0.090);mNGS诊断肺外结核的敏感度为62%(40/65),显著高于涂片法(5%,3/65)、Xpert法(31%,20/65)及培养法(18%,12/65), 三者比较差异均有统计学意义(均 P<0.001)。 结论:mNGS法检测MTB快速、高效,对于结核病特别是肺外结核病的诊断优于其他常用的诊断方法。
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编辑人员丨1周前
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GeneXpert MTB/RIF在快速诊断肺结核和检测利福平耐药中的临床应用价值
编辑人员丨1周前
目的:探讨GeneXpert MTB/RIF(简称Xpert)法在快速诊断肺结核及检测利福平耐药性中的临床价值。方法:收集2018年1月至2019年3月上海市松江区中心医院感染科门诊1 059例疑似肺结核患者痰标本,均行Xpert、涂片抗酸染色和结核分枝杆菌液体培养检测。结果:1 059例疑似肺结核患者中,诊断临床肺结核398例(其中确诊病例297例),非肺结核661例[其中非结核分枝杆菌(NTM)肺病6例]。在疑似病例、临床诊断病例和确诊病例中,Xpert法检测的阳性率分别为21.53%(228/1 059)、57.29%(228/398)和71.04%(211/297),均较涂片法[12.09%(128/1 059)、30.65%(122/398)和39.39%(117/297)]显著升高( χ2=33.77、57.30、60.16, P值均<0.01),但疑似和临床诊断病例Xpert法阳性率较液体培养法[28.61%(303/1 059)、74.62%(297/398)]明显偏低( χ2=14.14、26.64, P值均<0.01)。Xpert法在痰涂片阳性和痰培养阳性患者中的阳性率分别为91.41%(117/128)和69.64%(211/303);确诊病例中,Xpert法对痰涂片阳性患者的诊断符合率为98.29%(115/117),对痰涂片阴性患者的检出率为53.33%(96/180)。以肺结核确诊为金标准,Xpert法和涂片法诊断肺结核的敏感性分别为71.04%(211/297)、39.39%(117/297),特异性分别为97.77%(745/762)、98.56%(751/762);与涂片法相比,Xpert法的敏感性显著升高( χ2=60.16, P<0.01),2种方法的特异性差异无统计学意义。痰涂片阳性、培养阳性而Xpert检测阴性的患者有8例,其中确诊为NTM者6例;以药敏检测利福平耐药作为金标准,Xpert法诊断利福平耐药的敏感性为76.92%(10/13),特异性为98.59%(280/284),阳性预测值为71.43%(10/14),阴性预测值为98.94%(280/283)。 结论:Xpert在早期诊断肺结核、NTM鉴定和检测利福平耐药等方面具有较好的临床应用价值。
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编辑人员丨1周前
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GeneXpert MTB/RIF对结核病的诊断价值及复治患者群体特征分析
编辑人员丨1周前
目的:探讨GeneXpert MTB/RIF(简称Xpert)法诊断肺结核的可靠性及了解复治患者群体特点,为复治结核病患者人群调查提供线索。方法:收集2019年7月至12月来南华大学附属长沙中心医院结核科就诊的疑似肺结核患者痰液905例,采用Xpert法进行结核病快速筛查,并用MGIT960进行痰快速培养及传统药敏试验,比较Xpert法和传统药敏方法学差异。查阅Xpert阳性患者资料,比较初治/复治患者性别、年龄、RIF耐药、职业以及患糖尿病差异性,并采用二元logistic回归分析RIF耐药相关危险因素。结果:905例疑似肺结核患者中Xpert检测总的检出率为28.7%(260/905);260例阳性患者中利福平(RIF)耐药率为20.8%(54/260),突变类型以Probe-E和Probe-D为主;传统药敏法与Xpert法检测RIF耐药性差异无统计学意义( P>0.05);Xpert法和传统药敏病例中,Xpert法预测异烟肼(INH)耐药性差异无统计学意义( P=0.293);Xpert阳性初治和复治患者相比,两者年龄( t=-3.835, P<0.05)、性别、RIF耐药率和农民占比差异均具有统计学意义(χ 2=5.091、16.862、4.808、 P<0.05);二元logistic回归结果显示,患者复治是影响RIF耐药结局的相关危险因素( OR=3.739, P=0.004)。 结论:Xpert法诊断肺结核病及RIF耐药临床应用价值较高;复治患者年龄较大,农民家庭男性占比较大、对RIF耐药率较高。
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编辑人员丨1周前
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灌洗液结核分枝杆菌及利福平耐药快速检测、结核分枝杆菌培养及脱氧核糖核酸检测在肺结核诊断中的应用价值分析
编辑人员丨1周前
目的:分析灌洗液结核分枝杆菌(TB)及利福平耐药快速检测(XpertMTB/RIF)、TB培养及TB脱氧核糖核酸(TB-DNA)检测在肺结核诊断中的应用价值。方法:选取温州市中心医院2018年1月至2020年1月收治且经临床诊断为肺结核的患者75例作为研究对象。以临床诊断结果作为金标准,分析XpertMTB/RIF检测、TB培养及TB-DNA检测肺结核的敏感性、特异性及准确性,并评估TB对利福平耐药性及患者痰中带血、发热等不良反应情况。结果:XpertMTB/RIF检测诊断肺结核的敏感性、特异性、准确性分别为95.24%、72.71%、85.33%;TB培养检测诊断肺结核的敏感性、特异性、准确性分别为80.95%、66.67%、74.67%;TB-DNA检测诊断肺结核的敏感性、特异性、准确性分别为78.57%、69.70%、74.67%。XpertMTB/RIF检测肺结核的敏感性与TB培养检测、TB-DNA检测比较,差异均有统计学意义(χ 2=4.086、5.126, P=0.043、0.024)。以临床诊断结果为金标准,在获取的阳性标本中,XpertMTB/RIF对耐药性检测的灵敏度、特异度分别为72.73%、93.55%;TB培养对耐药性检测的灵敏度、特异度分别为54.55%、74.19%;TB-DNA对耐药性检测的灵敏度、特异度分别为63.64%、70.97%。XpertMTB/RIF对耐药性检测的灵敏度、特异度均高于TB培养与TB-DNA检测,差异均有统计学意义(χ 2=4.292、5.415, P=0.038、0.020)。进行纤维支气管镜检查、肺泡灌洗及刷检过程中,75例患者均未出现严重不良反应,术后可见2例痰中带血、1例发热,以上患者在1~3 d后不良反应均消失。 结论:XpertMTB /RIF检测、TB培养及TB-DNA检测在肺结核诊断中均有较好的应用价值,但在快速检测肺结核及利福平耐药方面,XpertMTB/RIF检测的准确性更好。
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编辑人员丨1周前
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超声造影引导下粗针活检联合XpertMTB/RIF检测在周围型肺结核诊断中的应用价值
编辑人员丨1个月前
目的:评估超声造影引导下粗针活检联合半巢式全自动实时荧光定量核酸扩增检测技术(XpertMTB/RIF)在周围型肺结核诊断中的应用价值。方法:回顾性分析2016年6月至2018年6月浙江省中西医结合医院结核科疑似周围型肺结核的71例住院患者,所有患者肺部肿块均经超声造影引导下穿刺活检,穿刺组织标本分别进行常规病理检查、XpertMTB/RIF检测及结核分枝杆菌(MTB)培养,以“肺结核诊断和治疗指南”为诊断金标准,比较3种检测方法诊断周围型肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及准确性。并计算受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC),采用t检验比较3种诊断方法的诊断效能差异。以药敏试验为诊断结核标准,评估XpertMTB/RIF方法检验利福平耐药的准确性。结果:71例患者诊断为周围型肺结核40例(结核组),非周围型肺结核患者31例(非结核组)。非结核组包括肺部恶性肿瘤10例,肺部良性肿瘤1例,间质性肺炎14例,胞内分枝杆菌肺炎3例,真菌性肺炎3例。常规病理、XpertMTB/RIF检测及MTB培养3种检测方法的诊断敏感度分别为80.0%、92.5%、12.5%,特异度分别为90.3%、100%、100%,阳性预测值分别为91.4%、100%、100%,阴性预测值分别为77.8%、91.2%、47.0%,准确性分别为84.5%、95.8%、50.7%。XpertMTB/RIF的诊断敏感度高于常规病理检查及MTB培养,差异具有统计学意义(χ2=33.632、5.976,P均<0.05)。ROC曲线分析显示常规病理、XpertMTB/RIF检测及MTB培养3种检查方法AUC分别为0.814、0.963、0.563,XpertMTB/RIF的诊断效能优于常规病理检查及MTB培养,AUC比较,差异具有统计学意义(t=7.579、2.303,P均<0.05)。结论:超声造影引导下粗针活检联合XpertMTB/RIF检测技术能快速、准确地对周围型肺结核进行诊断,相对于常规病理检查、MTB培养具有较高的诊断效能。
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编辑人员丨1个月前
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2型糖尿病合并肺结核患者空腹血糖水平与痰涂片、T-SPOT.TB结果的关系及结核分枝杆菌rpoB基因检测临床意义
编辑人员丨1个月前
目的 探究 2 型糖尿病(type 2 diabetes nephropathys,T2DM)合并肺结核患者空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)水平与痰涂片、结核分枝杆菌T细胞斑点实验(T-cell spot test for tuberculosis infection,T-SPOT.TB)结果的关系及结核分枝杆菌rpoB基因检测的临床意义.方法 选取2022年1月—2023年1月昆明市第三人民医院收治102例T2DM合并肺结核患者作为研究组,另选同期在我院治疗的102例单纯肺结核患者作为对照组.比较2组临床资料、痰涂片和T-SPOT.TB检查结果,并对研究组不同FPG水平患者痰涂片阳性率、T-SPOT.TB阳性率进行比较,分析痰涂片阳性率、T-SPOT.TB阳性率与患者FPG水平的相关性.对 2 组进行结核分枝杆菌培养,分离利福平(rifampicin,RFP)耐药菌株和敏感菌株,比较2组2种菌株rpoB基因检测结果.结果 研究组咳嗽、呼吸困难、厌食、盗汗、胸痛、咯血、发热发生率、痰涂片阳性率、T-SPOT.TB阳性率均高于对照组(P均<0.05).不同FPG水平患者痰涂片阳性率比较,差异具有统计学意义(P=0.003);T-SPOT.TB阳性率比较,差异无统计学意义(P=0.262);痰涂片阳性率与T2DM合并肺结核患者FPG水平呈正相关(rs=0.386,P=0.015),T-SPOT.TB阳性率与FPG水平无明显相关性(rs=0.127,P=0.326).研究组RFP耐药菌株多于对照组,研究组RFP耐药菌株rpoB基因突变率高于RFP敏感菌株(P均<0.05).结论 T2DM合并肺结核患者FPG水平与痰涂片结果呈正相关,但与T-SPOT.TB结果无相关性.与单纯肺结核患者相比,T2DM合并肺结核患者更易感染耐药株.通过检测耐药基因rpoB,可快速识别检测结核分枝杆菌对RFP耐药性,为临床治疗提供科学指导.
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编辑人员丨1个月前
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结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的快速分子诊断方法构建
编辑人员丨2024/7/20
目的 采用快速分子诊断方法中TaqMan荧光定量PCR技术,应用于利福平和异烟肼一线抗结核药物耐药基因的诊断中,评价其性能,建立高灵敏度、高特异度、高准确性并且快速的筛查方法,为结核分枝杆菌耐药性的诊断和治疗提供依据并探讨其应用价值,努力改善耐药结核病的检测和可行性.方法 本研究针对利福平ropB基因531位点突变和异烟肼katG基因315位点突变的特点,设计TaqMan-MGB引物和探针,通过反应条件优化,建立TaqMan荧光定量PCR方法;用克隆到pUC57载体上的阳性标准品及不同菌株评价该方法的特异性、灵敏度、重复性和精密度,采用甘油三酯、胆红素和血红素进行了干扰性实验.结果 TaqMan荧光定量PCR方法的检测限可达10copies/μl;在交叉干扰实验中,检测了 5种常见呼吸道感染细菌国家标准菌株,均未检出,基因野生型和突变型探针特异性较好,不受其它基因干扰;批内、批间的CT值变异系数均小于5%,标准曲线R2=0.998,扩增效率均在90%以上;该反应迅速,检测时间为1h.结论 本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法有助于及时发现结核分枝杆菌耐药情况,对结核病的耐药检测与后续治疗具有重要意义.
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编辑人员丨2024/7/20
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飞行时间质谱在耐药结核病检测中的应用价值
编辑人员丨2024/7/6
目的 旨在建立一种基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)平台鉴定结核分枝杆菌及检测结核耐药突变位点的方法,并对其用于临床耐药结核病检测的应用价值进行评估.方法 采用MALDI-TOF-MS检测 3 株国家参考品菌株,测定其对于结核鉴定位点和耐药位点的最低检出限.以非随机抽样法,收集昆明市第三人民医院结核科 2023 年 1 月至9 月疑似结核病患者呼吸道样本,包括痰液样本 120 例,肺泡灌洗液样本 100 例,每例样本含量 3~5 mL.供试样本均提取核酸,先用结核荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)试剂盒筛选出Ct值≤32 的结核阳性样本,然后用MALDI-TOF-MS检测与利福平(rifampicin,RIF)、异烟肼(isoniazide,INH)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)、莫西沙星(moxifloxacin,MXF)、链霉素(streptomycin,SM)和吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)相关的耐药基因位点.同时采用表型药敏法和三代测序(Nanopore平台)对结核阳性样本进行检测并与MALDI-TOF-MS结果进行对比分析,验证其检测耐药结核的准确性.结果 对于结核鉴定位点IS6110 和ext_RD9,MALDI-TOF-MS的最低检出限为 60~100 CFU/mL;对于结核耐药位点,MALDI-TOF-MS的最低检出限为100~1000 CFU/mL.经qPCR法鉴定Ct值≤32 的结核阳性标本共 132 例.对比表型药敏结果,MALDI-TOF-MS检测耐药的敏感度、特异度和kappa值分别是:RIF为 93.75%、100%和 0.96;INH为 98.33%、90.28%和 0.88;EMB为 83.33%、97.50%和0.78;MXF为 95.45%、100%和 0.97.与三代测序结果相比,MALDI-TOF-MS检测耐药的敏感度、特异度和kappa值分别是:RIF 为 90.91%、100%和 0.94;INH 为 92.96%、100%和 0.92;EMB 为 92.86%、100%和 0.96;MXF 为95.45%、100%和 0.97;SM为 95.74%、100%和 0.97;PZA为 66.67%、100%和 0.80.结论 MALDI-TOF-MS针对抗结核药物的耐药检测结果与表型药敏和三代测序检测结果对比高度一致,可作为快速检测结核耐药的一种有效方法.
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编辑人员丨2024/7/6
