目的 构建人源自噬微管相关蛋白轻链3A(microtubule-autophagy-related protein 1 light chain 3 A,mRFP-C1-LC3A)过表达质粒,并观察其在氯化钴(CoCl2)诱导的大鼠心肌细胞(H9C2细胞)缺氧模型中表达及抗凋亡机制.方法 利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术以cDNA文库为模板克隆人源轻链3A(light chain 3A,LC3A)基因,构建mRFP-C1-LC3A过表达质粒.通过0.8 mmol/L CoCl2 处理H9C2细胞,构建大鼠心肌细胞缺氧模型.应用Western-blot以及荧光成像技术检测细胞缺氧模型中的线粒体自噬水平的变化.通过Western-blot检测H9C2细胞缺氧模型中线粒体自噬水平不同对凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl2)、胱天蛋白酶3(caspase-3)表达的影响.结果 质粒酶切、测序结果及Western-blot实验证明mRFP-C1-LC3A真核表达载体构建成功.Western-blot结果表明经 0.8 mmol/L CoCl2 处理H9C2 细胞后,细胞内低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF1α)蛋白表达上调、Hoechst/碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色证实心肌细胞凋亡比例增加,缺氧模型构建成功(P<0.05).结合Western-blot以及荧光成像结果显示在H9C2细胞缺氧模型中线粒体自噬水平明显升高(P<0.05).通过巴佛洛霉素A1(BafA1)抑制线粒体自噬后,凋亡相关蛋白Bcl2表达下降、活化caspase-3表达升高,表明抑制线粒体自噬后,细胞凋亡水平进一步升高(P<0.05),Hoechst染色进一步明确结论.结论 成功构建人源LC3相关表达载体,并证实线粒体自噬可以抑制心肌细胞缺氧模型中的细胞凋亡.

目的:探索长链非编码RNA B230352I09基本生物学特征及其在心肌损伤过程中的作用。方法:利用UCSC网站（http://genome.ucsc.edu）分析lncRNA B230352I09的生物学特征；通过catRAPID预测B230352I09可能结合蛋白；使用实时荧光定量（RT）PCR方法检测lncRNA B230352I09在小鼠出生后7 d内不同时间点（0、1、3、7ｄ）的心脏组织中的表达情况；lncRNA B230352I09在新生小鼠器官分布表达情况；lncRNA B230352I09在心肌损伤小鼠心脏中的表达规律。培养原代心肌细胞，构建缺氧模型，采用Hoechst染色试剂盒检测lncRNA B230352I09过表达对缺氧心肌细胞凋亡的影响；DCFDA探针法检测lncRNA B230352I09过表达对缺氧心肌细胞ROS含量影响；JC-1荧光探针检测缺氧心肌细胞线粒体膜电位变化。结果:LncRNA B230352I09在小鼠基因组定位于7号染色体:123031415-123066439 forward strand，全长663 bp。与该lncRNA相邻基因为Rbbp6。通过catRAPID预测lncRNA结合蛋白显示Rbbp6可能为B230352I09的作用靶标。随着心脏发育，lncRNA B230352I09表达水平呈逐渐下降趋势。lncRNA B230352I09在新生1 d小鼠心、脑、肾、肝组织中均有表达；进一步取心脏组织提取心肌细胞检测发现lncRNA B230352I09在非心肌细胞中的表达量明显少于心肌细胞[(1.0±0.03) vs. (9.2±3.29)， P=0.013]。lncRNA B230352I09在心肌损伤后表达水平随时间呈现逐渐下降趋势，而相对正常发育小鼠lncRNA B230352I09表达量增多，但差异无统计学意义。Hoechst染色发现lncRNA B230352I09可抑制缺氧后心肌细胞凋亡；检测心肌细胞ROS的含量显示，和缺氧组比较，lncRNA B230352I09过表达组心肌细胞ROS生成明显减少([(3.8±0.71) vs. (1.65±0.56)， P=0.015])；使用JC-1荧光探针检测线粒体的膜电位，结果显示lncRNA B230352I09过表达组心肌细胞线粒体膜电位较缺氧组明显增高。 结论:LncRNA B230352I09在心脏组织中主要表达于心肌细胞；在小鼠心肌损伤过程中具有保护作用，主要通过减少心肌细胞凋亡、减少ROS生成、保护心肌细胞线粒体膜电位发挥作用。

目的:探讨新生儿出生时不同缺氧程度下脐血中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）的水平以及其与缺氧器官（肝脏、肾脏、心脏）受损的关系。方法:前瞻性选择2022年4~10月湖南妇女儿童医院产科分娩的所有新生儿为研究对象，根据宫内/产程中缺氧情况分为健康对照组、缺氧无窒息组、缺氧窒息组。所有新生儿断脐后均采集脐动脉血检测脐血血气及NGAL水平，生后24~48 h完善肝肾功能、心肌酶检测，分析脐血NGAL水平与各检测指标间的关系。结果:共纳入161例新生儿，健康对照组91例，缺氧无窒息组49例，缺氧窒息组21例。缺氧窒息组脐血NGAL水平高于缺氧无窒息组和健康对照组［（1.81±0.71）ng/ml比（1.22±0.53）ng/ml、（0.88±0.47）ng/ml］，缺氧无窒息组高于健康对照组，差异均有统计学意义（ P<0.05）。脐血NGAL水平与新生儿性别、胎龄、出生体重、母亲年龄、体重指数、肌酸激酶同工酶MB均无显著相关性（ P>0.05），与Apgar评分、脐血血气pH、BE值存在较强负相关性（ r<-0.3， P<0.05），与乳酸、谷丙转氨酶、肌酐存在较强正相关性（ r>0.3， P<0.05）。受试者工作特征曲线分析显示，以谷丙转氨酶、肌酐、尿素氮、肌酸激酶同工酶MB联合作为新生儿肝脏、肾脏、心脏受损实验室标准，当NGAL水平截断值为1.07 ng/ml 时，其敏感度和特异度分别为84.3%、60.3%。 结论:脐血NGAL水平在新生儿出生时随着缺氧加重有升高趋势，可能与缺氧后器官（肝脏、肾脏、心脏）受损相关。

目的:探索小鼠心肌细胞中哺乳动物不育系20样激酶1（mammalian sterile 20-like kinase 1，Mst-1）调控缺氧复氧（hypoxia reoxygenation，HR）诱导的心肌细胞自噬及凋亡机制。方法:采用酶消化法结合差速贴壁的方法培养小鼠乳鼠心肌细胞，通过缺氧24 h复氧6 h的方法建立HR模型。实验分组：对照组：正常培养的心肌细胞；Mst-1空病毒组：用重组慢病毒空载体转染心肌细胞48 h；Mst-1敲低组：用携带Mst-1小干扰RNA（siRNA）的重组慢病毒转染心肌细胞48 h；Mst-1过表达组：用携带Mst-1基因的重组慢病毒转染心肌细胞48 h；HR组：建立心肌细胞HR模型；Mst-1敲低+HR组：用携带Mst-1 siRNA的重组慢病毒转染心肌细胞后48 h建立心肌细胞HR模型；Mst-1过表达+HR组：用携带Mst-1基因的重组慢病毒转染心肌细胞后48 h建立心肌细胞HR模型。采用实时荧光定量RCR（qPCR）以及Western blot检测细胞中Mst-1 mRNA及蛋白相对表达量，免疫荧光染色检测心肌细胞标志物心肌肌钙蛋白T（cTnT），及细胞自噬体与自噬溶酶体变化，脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）法检测心肌细胞凋亡水平，Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）Ⅱ/LC3Ⅰ，P62及凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶剪切体（cleaved-caspase）9、半胱氨酸天冬氨酸酶前体（pro-caspase）9、cleaved-caspase-3、pro-caspase-3，以及髓细胞白血病1基因（MCL-1）的表达情况达。予以MCL-1抑制剂A1210477做回复实验，验证Mst-1通过调控MCL-1参与心肌细胞凋亡及自噬。结果:免疫荧光检测发现培养细胞表达心肌细胞特异性标志物cTnT；HR情况下心肌细胞中Mst-1表达增加，慢病毒转染可有效抑制或过表达细胞中Mst-1。HR组与Mst-1过表达+HR组心肌细胞内自噬体及自噬溶酶体含量低于对照组，而Mst-1敲低+HR组心肌细胞内自噬体及自噬溶酶体含量高于HR组（ P均<0.05）。TUNEL结果显示，HR组及Mst-1过表达+HR组中TUNEL阳性细胞比例高于对照组，而Mst-1敲低组+HR组中TUNEL阳性细胞比例低于HR组（ P均<0.05）。Western blot结果显示，与对照组比较，HR组及Mst-1过表达+HR组细胞中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ值较低，P62与 cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3表达水平较高（ P均<0.05）；与HR组比较，Mst-1敲低+HR组中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ值较高，P62与cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3表达水平较低（ P均<0.05）。HR与Mst-1过表达+HR组心肌细胞中磷酸化（P）MCL-1蛋白表达水平低于对照组，Mst-1敲低+HR组的P-MCL-1蛋白表达水平高于HR组（ P均<0.05）。回复实验显示抑制细胞中MCL-1可阻断Mst-1 siRNA 对细胞自噬及凋亡的调节作用。 结论:抑制心肌细胞中Mst-1的表达，可促进HR诱导的心肌细胞自噬，改善心肌细胞凋亡，该作用可能与其调控MCL-1表达相关。

目的:探讨miR-125a-5p靶向调控清道夫受体B1( Scarb1)基因对缺氧/复氧大鼠心肌细胞损伤的影响及作用机制。 方法:将体外培养的H9c2大鼠心肌细胞随机分为空白对照组、缺氧/复氧组、转染对照组和miR-125a-5p转染组。检测各组miR-125a-5p的表达量、心肌细胞的活力、凋亡率、ATP含量以及Scarb1、Cyt C、Bax、Bcl-2及NF-κB信号通路相关蛋白的表达情况。利用Targetscan软件预测miR-125a-5p的靶基因，用双荧光素酶报告基因实验验证miR-125a-5p和 Scarb1的靶向关系。 结果:与空白对照组相比，缺氧/复氧组心肌细胞miR-125a-5p、Bax、Cyt C的表达和凋亡率明显升高( P<0.05)，细胞活力、Scarb1、Bcl-2的表达及ATP含量明显降低( P<0.05)。与转染对照组相比，miR-125a-5p转染组的情况与上述变化相反。双荧光素酶报告基因实验证实 Scarb1为miR-125a-5p的靶基因。缺氧/复氧能够促进心肌细胞中NF-κB p65、c-Myc和Cyclin D1蛋白的表达，而下调miR-125a-5p的表达则能够抑制上述蛋白的表达。 结论:缺氧/复氧能够诱导心肌细胞中miR-125a-5p的表达，抑制miR-125a-5p则能够通过上调 Scarb1的表达对缺氧/复氧心肌细胞起保护作用，其机制可能与抑制NF-κB信号通路的活化有关。

目的:评价TANK结合激酶1(TBK1)过表达对小鼠高糖离体心肌细胞缺氧复氧损伤的影响及其与线粒体自噬的关系。方法:正常培养的对数期小鼠HL-1心肌细胞，以1×10 6个/ml的密度接种于6孔板，采用随机数字表法分为4组( n＝10)：对照组(C组)、高糖组(HG组)、高糖缺氧复氧组(HG+H/R组)和TBK1过表达组(TBK1组)。细胞密度达到50%时使用含1%胎牛血清+1%双抗培养基孵育细胞24 h，细胞密度达到80%时，以pcDNA3.1(+)为载体进行TBK1过表达。采用高糖培养基(33 mmol/L)培养24 h，37 ℃培养箱缺氧(94%N 2+5%CO 2+1%O 2)24 h，37 ℃含5%CO 2培养箱复氧12 h，制备高糖心肌细胞缺氧复氧损伤模型。细胞复氧后采用CCK-8法检测细胞活力，采用LDH试剂盒检测上清液LDH活性，采用Mito-Tracter绿色荧光探针检测线粒体含量，采用Western blot法检测TBK1及线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3B和P62的表达。 结果:与C组比较，HG组和HG+H/R组小鼠心肌细胞活力降低，上清液LDH活性增加，线粒体含量减少，TBK1、PINK1、Parkin和LC3B表达下调，P62表达上调( P<0.05)；与HG组比较，HG+H/R组小鼠心肌细胞活力降低，上清液LDH活性增加，线粒体含量减少，TBK1、PINK1、Parkin和LC3B表达下调，P62表达上调( P<0.05)；与HG+H/R组比较，TBK1组小鼠心肌细胞活力升高，上清液LDH活性减少，线粒体含量增加，TBK1、PINK1、Parkin和LC3B表达上调，P62表达下调( P<0.05)。 结论:TBK1过表达减轻小鼠高糖离体心肌细胞缺氧复氧损伤的机制与其恢复线粒体自噬有关。

目的:评价ROS在吡那地尔后处理减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用及其与核因子E2相关因子2(Nrf2)-抗氧化反应元件(ARE)信号通路的关系。方法:分离、培养成年大鼠心肌细胞，采用随机数字表法分为4组( n＝20)：对照组(C组)、缺氧复氧组(H/R组)、吡那地尔后处理组(P组)和活性氧清除剂N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸(MPG)＋吡那地尔后处理组(MPG＋P组)。C组持续于37 ℃ 95%O 2＋5%CO 2培养箱中持续培养105 min；缺氧复氧损伤模型制备：5%CO 2＋1%O 2＋94%N 2条件下缺氧45 min，复氧60 min；P组缺氧45 min，吡那地尔50 μmol/L处理5 min，复氧60 min；MPG＋P组缺氧45 min，MPG 2 mmol/L处理10 min，吡那地尔处理5 min，复氧60 min。于复氧末检测心肌细胞Ca 2＋含量和Nrf2活性；观察心肌细胞超微结构，并行线粒体Flameng评分；采用Western blot法和RT-PCR法分别检测Nrf2、超氧化物歧化酶1(SOD1)、醌氧化还原酶1(NQO1)和血红素加氧酶1(HO-1)及其mRNA的表达。 结果:与C组比较，H/R组心肌细胞Ca 2＋含量、Nrf2活性和Flameng评分升高，Nrf2、SOD1、NQO1和HO-1及其mRNA表达下调( P<0.05)，心肌细胞超微结构损伤加重；与H/R组比较，P组心肌细胞Ca 2＋含量和Flameng评分降低，Nrf2活性升高，Nrf2、SOD1、NQO1和HO-1及其mRNA表达上调( P<0.05)，心肌细胞超微结构损伤减轻；与P组比较，MPG＋P组心肌细胞Ca 2＋含量和Flameng评分升高，Nrf2活性降低，Nrf2、SOD1、NQO1和HO-1及其mRNA表达下调( P<0.05)，心肌细胞超微结构损伤加重。 结论:ROS参与了吡那地尔后处理减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的过程，与激活Nrf2-ARE信号通路有关。

目的:研究脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells，ASCs)来源外泌体抑制高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)/核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)诱导心肌细胞损伤的影响。方法:购买ASCs细胞株、心肌H9c2细胞株，培养并鉴定ASCs并分离外泌体；培养心肌H9c2细胞并建立H/R损伤模型。将H9c2细胞分为对照组、H/R组、外泌体+H/R组。为验证HMGB1/NF-κB途径在外泌体减轻心肌细胞损伤中的作用，H9c2细胞被分为Ad-NC组、Ad-NC+H/R组、Ad-NC+H/R+外泌体组、Ad-HMGB1+H/R+外泌体组。检测各组细胞存活率、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、磷酸肌酸激酶( creatine phosphate kinase，CPK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量及HMGB1、NF-κB表达水平。结果:透视电镜及特异性蛋白CD9与CD63检测显示成功获得了ASCs并分离外泌体。外泌体2 μg/mL及细胞培养48 h分别为本研究的ASCs来源外泌体浓度及培养时间。与对照组、H/R+外泌体组比较，H/R组细胞存活率明显降低，细胞培养基中LDH、AST、CPK、IL-1β、TNF-α、MDA的含量明显增加，细胞中HMGB1、NF-κB的表达水平明显增加，组间差异均具有统计学意义( F值分别为64.81、81.38、77.38、94.71、53.82、71.38、49.57、29.59、41.38， P值均<0.05)。过表达HMGB1后，Ad-NC组、Ad-NC+H/R组及Ad-HMGB1+H/R+外泌体组细胞中HMGB1和NF-κB的表达水平较Ad-NC+H/R+外泌体组明显升高，组间差异具有统计学意义[(0.42±0.07)比(0.93±0.17)比(0.78±0.14)比(0.34±0.08)，(0.48±0.08)比(0.84±0.15)比(0.89±0.17)比(0.37±0.06)， F值分别为83.91、77.59， P值均<0.05]。与Ad-NC+H/R组比较，Ad-NC组、Ad-NC+H/R+外泌体组及Ad-HMGB1+H/R+外泌体组的细胞存活率明显升高，培养基中LDH、AST、CPK的含量明显降低，组间差异有统计学意义[ F值分别为71.85，103.85，88.47，115.49， P值均<0.05]；Ad-NC+H/R+外泌体组细胞存活率较Ad-HMGB1+H/R+外泌体组明显降低，培养基中LDH、AST、CPK的含量则较之明显增加，差异均有统计学意义[%：(81.25±9.77)比(53.23±8.12)，U/mL：(367.68±61.32)比(603.38±87.67)，U/mL：(26.34±5.18)比(40.38±9.12)，U/mL：(2.46±0.57)比(5.22±0.74)， P值均<0.05]。与Ad-NC组比较，Ad-NC+H/R组、Ad-NC+H/R+外泌体组及Ad-HMGB1+H/R+外泌体组细胞培养基中IL-1β、TNF-α、MDA含量明显升高，组间差异有统计学意义[ng/mL：(1.77±0.35)比(5.45±0.89)比(2.67±0.42)比(5.08±0.77)，ng/mL：(3.56±0.73)比(9.23±1.18)比(5.24±0.87)比(8.62±1.09)，μmol/mL：(0.91±0.14)比(2.15±0.45)比(1.31±0.27)比(1.89±0.29)， F值分别为91.58，83.58，64.84， P值均<0.05]。 结论:ASCs来源外泌体具有减轻心肌细胞H/R损伤的作用，这一作用与抑制HMGB1/NF-κB途径介导的炎症反应及氧化应激反应有关。

目的:评价活性氧(ROS)在缺氧后处理激活大鼠心肌细胞核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路中的作用。方法:分离、培养成年大鼠原代心肌细胞，采用随机数字表法分成4组( n＝20)：正常组(N)、缺氧复氧组(HR组)、缺氧后处理组(HPO组)及HPO+ROS清除剂组(HPO+MPG)。采用缺氧45 min复氧60 min的方法制备心肌细胞缺氧复氧损伤模型；HPO组缺氧45 min后，行3个循环的氧合5 min-缺氧5 min处理，再复氧60 min；HPO+MPG组缺氧35 min时加入ROS清除剂N-(2-硫基丙酰)-甘氨酸(终浓度2 mmol/L)继续缺氧处理10 min，余同HPO组。于复氧末，检测心肌细胞内Ca 2+水平和Nrf2活性，观察心肌细胞超微结构并进行线粒体Flameng评分；采用Western blot法和RT-PCR法分别检测心肌细胞Nrf2、醌氧化还原酶(NQO1)、SOD1、血红素加氧酶1(HO-1)及其mRNA表达。 结果:与N组比较，HR组心肌细胞内Ca 2+水平、Nrf2活性和Flameng评分升高，Nrf2、NQO1、SOD1、HO-1及其mRNA表达下调( P<0.05)；与HR组比较，HPO组心肌细胞内Ca 2+水平和Flameng评分降低，Nrf2活性升高，Nrf2、NQO1、SOD1、HO-1及其mRNA表达上调( P<0.05)；与HPO组比较，HPO+MPG组心肌细胞内Ca 2+水平和Flameng评分升高，Nrf2活性降低，Nrf2、NQO1、SOD1、HO-1及其mRNA表达下调( P<0.05)。 结论:缺氧后处理激活大鼠心肌细胞Nrf2/ARE信号通路的机制可能与ROS有关。

目的:研究抑制高迁移率族蛋白B1（HMGB1）/信号转导及转录激活因子3（STAT3）轴活性对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。方法:建立大鼠心肌缺血再灌注损伤的体内和体外模型，SD大鼠随机分为假手术组、模型组、甘草酸组和NSC74859组，每组6只。假手术组不结扎，假手术组和模型组不给药，甘草酸组和NSC74859组大鼠在缺血/再灌注前12 h 30 min和缺血后30 min分别尾静脉注射HMGB1拮抗剂甘草酸或STAT3抑制剂NSC74859 5 mg/kg。采用超声心动图评价心功能指标左心室缩短分数（FS）和左心室射血分数（EF），采用苏木精-伊红（HE）染色和TUNEL染色评估心肌细胞的凋亡，采用实时荧光定量PCR反应和Western Blot法检测HMGB1、STAT3和磷酸化STAT3（p-STAT3）的表达水平。MTS法测定H9C2细胞活力，通过细胞内腺苷三磷酸（ATP）含量测定和流式细胞术检测H9C2细胞的线粒体膜电位评估心肌细胞的存活。采用免疫沉淀法研究HMGB1/STAT3的作用方式。采用免疫染色法检测HMGB1/STAT3在细胞核和细胞质中的表达和迁移情况。结果:抑制HMGB1或STAT3的表达后，大鼠EF和FS均升高，心肌细胞免疫浸润和凋亡下降；抑制HMGB1表达可降低STAT3的表达，但抑制STAT3表达不影响HMGB1的表达。缺氧导致HMGB1、p-STAT3表达升高，STAT3表达降低，在缺氧8 h时，STAT3表达水平突然升高。复氧后HMGB1、STAT3表达降低，p-STAT3表达升高，但p-STAT3（Ser 727）未参与该过程。缺血再灌注损伤后，HMGB1和STAT3在心肌细胞中牢固结合，但抑制STAT3或HMGB1会减弱这种结合。抑制HMGB1或STAT3表达可减轻心肌缺血再灌注损伤。缺氧后再复氧心肌细胞HMGB1表达增加，HMGB1从细胞核向细胞质迁移。结论:抑制HMGB1/STAT3轴活性可有效降低大鼠心肌缺血再灌注损伤。