目的:研究应用胚胎外胚层发育(EED226)抑制组蛋白甲基化过度修饰是否具有抗癌活性并研究相关分子机制。方法:体外培养肝癌细胞株BEL-7402和SMMC7721，用不同浓度的EED226处理肝癌细胞4、6、8 d，细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活性；5 μmol/L的EED226或者二甲基亚砜(DMSO)处理肝癌BEL-7402和SMMC7721细胞株48 h，分别采用蛋白质印迹(Western blot)检测EED226对肝癌细胞组蛋白3上的第27位赖氨酸的三甲基化(H3K27me3)的表达水平的影响和定量反转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western blot检测EED226对肝癌细胞株的Bcl-2相互作用细胞死亡介导因子(Bim)和细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(p21)的表达水平的影响。组间比较采用 t检验。 结果:EED226能强效抑制肝癌细胞株BEL-7402和SMMC7721的增殖，抑制效应呈现明显的时间、浓度依赖作用。处理8 d后，EED226在两个细胞株中的半数细胞活性抑制率(IC 50)分别为0.8 μmol/L和0.9 μmol/L。分子机制研究结果显示，2个肝癌细胞株分别经EED226处理与DMSO处理后H3K27me3的表达相比较显著下降。在BEL-7402和SMMC7721细胞中，EED226处理组H3K27me3的下游基因Bim和p21的mRNA相对表达水平高于DMSO组[1.00±0.15比5.67±1.53( t＝-5.266， P<0.01)，1.00±0.05比6.67±1.53( t＝-6.422， P<0.05)和1.00±0.25比6.30±1.50( t＝-5.968， P<0.05)，1.00±0.10比6.00±1.00( t＝-8.617， P<0.05)]，差异有统计学意义；相应的Bim和p21蛋白质水平均显著升高。 结论:表观遗传调控新型抗癌制剂EED226能够抑制肝癌细胞中组蛋白三价甲基化过度修饰，进而解除对Bim和p21表达的抑制，达到抑制肝癌细胞增殖，表明EED抑制剂具有一定的抗肝癌作用。

目的:探讨LL-37及其衍生肽LL-37R对糖尿病创面愈合的影响。方法:高糖条件下培养小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，采用活/死染色及细胞计数试剂盒(CCK-8)检测LL-37和LL-37R对细胞活性的影响，划痕实验和成管实验评价对HUVEC细胞增殖和迁移能力的影响。选用36只雄性SD大鼠制作糖尿病创面模型，随机分为对照组、LL-37组和LL-37R组，每组12只。在背部制作直径2 cm的圆形全层皮肤创面，伤后每2 d分别于皮下注射生理盐水、LL-37、LL-37R，伤后第0、3、7、14、21天拍照，第21天取材进行苏木精-伊红(HE)染色、Masson染色和免疫组织化学染色评估创面愈合情况。采用ANOVA分析和非配对 t检验进行数据分析。 结果:LL-37R能够缓解高糖环境下NIH/3T3细胞和HUVEC细胞的损伤，并且表现出促进HUVEC细胞迁移和成血管的能力。对于大鼠糖尿病创面，在造模后21 d，LL-37组和LL-37R组的平均创面面积占初始创面的比例分别为(31.46±5.51)%、(18.01±4.29)%，均显著小于对照组[(41.10±4.54)%， t＝3.01、2.83， P<0.05]；HE染色结果显示，LL-37组和LL-37R组的创面表皮厚度分别为(73.06±17.67)、(70.35±4.60) μm，大于对照组[(26.94±11.61) μm， t＝2.18、3.48， P<0.05]，且LL-37R组基本完成了上皮化过程；Masson染色结果显示，LL-37R处理过后的真皮中胶原纤维比例更高( F＝78.61， P<0.01)，且排列更加有序和紧密；免疫组织化学染色结果表明，LL-37R组的CD31阳性血管密度为(221.62±18.69)个/mm 2，与对照组[(100.38±11.94)个/mm 2]和LL-37组[(117.95±16.01)个/mm 2]比较，血管形成最为显著( F＝17.02， P<0.01)，且LL-37R组创面中被CD86标记的炎性巨噬细胞数量[(20.18±5.08)个/mm 2]明显少于LL-37组[(61.82±8.101)个/mm 2]和对照组[(236.00±17.89)个/mm 2， F＝95.59， P<0.01]。 结论:LL-37及其衍生肽能够通过促进血管再生、胶原沉积和调节炎症加速糖尿病创面的愈合。

目的:本研究旨在探索铅染毒是否会导致斑马鱼焦虑的发生，并对其机制进行初步探索。方法:于2020年5月，收集受精后4 h（4hpf）的斑马鱼胚胎，以E3培养液作为对照组，不同的铅染毒浓度（6、12、24、48 μmol/L）作为染毒组，染毒时间为140 h。计算144 hpf斑马鱼的胚胎死亡率、胚胎孵化率和幼鱼畸形率；观察144 hpf幼鱼的行为学变化（运动速度、移动距离、活跃度、绝对转角、光照惊恐反应、黑暗逃避反应和趋触性）。并且检测斑马鱼幼鱼头部的活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）水平。用ELISA试剂盒检测与焦虑相关的神经递质5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NA）和促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）的表达量。结果:12、24和48 μmol/L铅染毒组斑马鱼胚胎死亡率高于对照组，胚胎孵化率低于对照组，24和48 μmol/L铅染毒组斑马鱼幼鱼畸形率高于对照组（ P<0.01）；24和48 μmol/L铅染毒组幼鱼运动速度、活跃度和趋触性低于对照组，绝对转角高于对照组，48 μmol/L铅染毒组幼鱼移动距离和黑暗逃避反应低于对照组，12、24和48 μmol/L铅染毒组幼鱼的光照惊恐反应低于对照组（ P<0.05）。24和48 μmol/L铅染毒组幼鱼头部ROS水平和MDA浓度高于对照组（ P<0.05）；12、24和48 μmol/L铅染毒组幼鱼头部NA和DA的含量低于对照组，24和48 μmol/L铅染毒组幼鱼头部5-HT和CRH浓度高于对照组（ P<0.05）。 结论:铅对斑马鱼有一定的胚胎发育毒性，且可导致斑马鱼发生焦虑样神经行为、神经递质改变以及氧化应激的发生。

目的:探讨复合人表皮干细胞（ESC）的猪脱细胞真皮基质（ADM）对裸鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响。方法:采用实验研究方法。采用数码相机拍照观察猪ADM形态，采用苏木精-伊红（HE）染色观测猪ADM中细胞残留，采用扫描电子显微镜观察猪ADM表面结构，采用红外光谱仪分析猪ADM二级结构，采用动态光散射粒度分析仪分析猪ADM粒径，采用纳米粒度电位仪分析猪ADM电位。采用倒置荧光显微镜观察猪ADM在培养基中放置30 min、1 d、5 d的形态（样本数为2）；采用随机数字表法（分组方法下同）将猪ADM分为5 min组、10 min组、20 min组、30 min组、60 min组、120 min组，常温静置相应时间，称量法计算吸水量（样本数为3）；将Swiss小鼠胚胎成纤维细胞（Fb）分为仅有培养基的空白对照组和另加入相应终质量浓度的ADM浸提液的50.0 g/L ADM浸提液组、37.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组、12.5 g/L ADM浸提液组、6.5 g/L ADM浸提液组，分别于培养24、48、72 h，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖率并进行细胞毒性分级（样本数为5）；将1只6周龄雄性SD大鼠红细胞分为生理盐水组、超纯水组及添加相应终质量浓度猪ADM浸提液的5 mg/mL ADM浸提液组、10 mg/mL ADM浸提液组、15 mg/mL ADM浸提液组，于反应3 h，采用酶标仪检测血红蛋白的吸光度值代表猪ADM血液相容性（样本数为3）。从陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院泌尿外科2020年7月收治的1名6岁健康男童包皮环切术后废弃包皮中分离培养ESC并采用流式细胞术鉴定。混合培养法构建复合ESC的猪ADM（以下简称ESC/ADM）颗粒，培养3 d后采用HE染色和激光扫描共聚焦显微镜观察ESC/ADM复合效果。将36只7~8周龄雄性无胸腺裸鼠分成单纯磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组，每组9只，并建立全层皮肤缺损创面模型，伤后即刻，创面均一次性采用相应试剂处理。分别于伤后1、7、11、15 d，观察创面愈合情况并计算创面愈合率（样本数为3）；伤后7 d，行HE染色观察创面上皮化情况并测量未上皮化长度（此处及以下样本数均为4）；伤后11 d，行Masson染色观察创面胶原沉积和真皮化情况并计算创面切面真皮面积，行免疫荧光染色并计算创面表达ESC特异性标志物CD49f的细胞数，行实时荧光定量反转录PCR检测创面移植ESC的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的mRNA表达。对数据行独立样本 t检验、单因素方差分析、重复测量方差分析、LSD- t检验。 结果:猪ADM为白色微粒状，内部无细胞存在，由网状结构组成，结构排列无序，表面粗糙；猪ADM分别在1 659、1 549、1 239 cm -1波数处出现吸收峰；猪ADM在溶液中主要粒径分布在500~700 nm；猪ADM表面带负电荷。放置30 min、1 d、5 d，猪ADM均形态相对稳定；放置30~120 min猪ADM吸水量保持相对高水平。6.5 g/L ADM浸提液组、12.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组小鼠胚胎Fb在培养24 h细胞毒性分级为1级，其余各组各时间点细胞毒性分级均为0级。反应3 h，超纯水组红细胞中血红蛋白的吸光度值明显高于生理盐水组和15 mg/mL ADM浸提液组（ t值分别为8.14、7.96， P<0.01）。第4代细胞常规培养3 d形态呈鹅卵石样且低表达CD71和高表达CD49f的被鉴定为ESC。猪ADM颗粒上有ESC附着、生长。伤后1 d，单纯PBS组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面大小基本一致。伤后7、11、15 d，各组裸鼠创面收缩，其中单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面收缩明显。伤后7 d，单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面愈合率明显高于单纯PBS组（ t值分别为2.83、4.72， P<0.05或 P<0.01）；伤后11 d，ESC/ADM组裸鼠创面愈合率明显高于单纯PBS组（ t=4.86， P<0.01）；伤后15 d，单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面愈合率均明显高于单纯PBS组（ t值分别为2.71、2.90、3.23， P<0.05）。伤后7 d，单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面未上皮化长度分别为（816±85）、（635±66）、（163±32）μm，明显短于单纯PBS组的（1 199±43）μm（ t值分别为5.69、10.19、27.54， P<0.01）。伤后11 d，单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面切面真皮面积明显大于单纯PBS组（ t值分别为27.14、5.29、15.90， P<0.01）；单纯ADM组和ESC/ADM组裸鼠创面的胶原生成比单纯PBS组明显，单纯ESC组和单纯PBS组相近。伤后11 d，单纯ESC组和ESC/ADM组裸鼠创面中CD49f表达阳性数量分别为（135±7）、（185±15）个，GAPDH的mRNA表达阳性；单纯PBS组、单纯ADM组裸鼠创面均无CD49f、GAPDH的mRNA表达。 结论:ESC/ADM颗粒能够促进裸鼠全层皮肤缺损创面愈合，这可能与其提高了ESC移植后的存活率和ADM促进了真皮结构重排、血管新生有关。

目的:构建双层含骨基质骨器官芯片并用于体外模拟成骨细胞和破骨细胞分化，为抗骨质疏松药物开发提供新平台。方法:使用WorkSoild软件制作双层双通道骨器官芯片设计图，利用光刻技术制备浇注母版。以聚二甲基硅氧烷（PDMS）为原料，通过模具浇注制备芯片主体。以牛皮质骨片为间隔，分隔培养室4个通道进出口采用储液柱封闭。芯片验证实验分为成骨、破骨诱导组和成骨、破骨对照组，成骨、破骨诱导组将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1和小鼠巨噬细胞RAW264.7分别接种于芯片上，成骨诱导14 d，破骨诱导7 d。成骨、破骨对照组为不进行诱导的MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞。观察指标包括：（1）芯片外观及密封性：芯片制备完成后拍照观察外观并通过密封实验观察密封性能。（2）生物相容性：MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞接种于芯片培养3 d及培养1、3、5 d后，分别采用钙黄绿素乙酰氧基甲酯/碘化丙啶（AM/PI）染色和细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK-8）实验观察细胞存活情况。（3）成骨分化情况：对成骨诱导组细胞进行碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色观察成骨细胞诱导情况。收集成骨诱导组和成骨对照组细胞RNA，qPCR检测成骨细胞标志基因Runt相关转录因子2（RUNX2）、骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原（COL1A1）表达情况，观察成骨细胞分化程度和成骨能力。（4）破骨分化情况：对破骨诱导组细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察破骨细胞分化情况。提取破骨诱导组和破骨对照组细胞RNA进行破骨分化基因qPCR，检测破骨细胞标志基因TRAP、组织蛋白酶K（CTSK）和树突状细胞特异性跨膜蛋白（DC-STAMP）表达水平。结果:双层含骨基质骨器官芯片大小为3 cm×3 cm，整体透光，芯片系统结构对接紧凑，无渗液。钙黄绿素AM/PI染色结果显示，MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞培养3 d后，呈红色荧光死细胞极少。CCK-8实验结果显示，MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞培养5 d内，细胞活力均在90%以上，表明芯片生物相容性好，细胞可以正常存活并增殖。ALP染色和茜素红染色结果显示，成骨诱导14 d，成骨诱导组MC3T3-E1细胞成功分化为成骨细胞并产生钙化结节。qPCR结果显示，成骨诱导组MC3T3-E1细胞的RUNX2相对表达量为4.98±0.74，显著高于对照组的0.99±0.03（ P<0.01）；MC3T3-E1细胞的OCN相对表达量为7.98±0.76，显著高于对照组的1.00±0.06（ P<0.01）；MC3T3-E1细胞的COL1A1相对表达量为7.07±0.56，显著高于对照组的0.97±0.03（ P<0.01）。TRAP染色结果显示，破骨诱导7 d，破骨诱导组RAW264.7细胞形成巨大的多核破骨细胞，破骨细胞表达大量TRAP蛋白。qPCR检测结果显示，破骨诱导组RAW264.7细胞的TRAP相对表达量为3.35±0.37，显著高于对照组的1.01±0.06（ P<0.01）；RAW264.7细胞的CTSK相对表达量为3.46±0.79，显著高于对照组的1.01±0.05（ P<0.01）；RAW264.7细胞的DC-STAMP相对表达量为1.92±0.12，显著高于对照组的0.98±0.08（ P<0.01）。 结论:双层含骨基质骨器官芯片结构紧凑，可长期体外培养，生物相容性好，可进行成骨和破骨细胞分化诱导，有望为骨质疏松机制探究和药物筛选提供新的研究平台。

目的:比较不同胚胎培养试剂对胚胎发育时间动力学参数、胚胎发育潜能及临床妊娠结局影响。方法:回顾性分析2016年9月至2018年5月期间于郑州大学第一附属医院生殖医学中心行体外受精/卵胞质内单精子注射(IVF/ICSI)助孕患者资料，按照胚胎培养试剂不同，分为Vitrolife组和Cook组，比较符合入选标准的470个新鲜移植周期患者的胚胎时间动力学参数、胚胎发育潜能及临床妊娠结局。结果:与Cook组比较，Vitrolife组原核出现时间、消失时间、发育到3-细胞和8-细胞时间更快[tPNa：（7.12±2.71） h比（7.40±2.61） h，tPNf：（23.83±4.33） h比（24.21±4.74） h，t3：（35.75±6.03） h比（36.64±6.16）h，t4：（38.30±6.25）h比（38.92±6.06）h， t5：（47.59±7.85）h比（49.01±7.86）h， t6：（50.77±7.17） h比（52.12±6.99） h，t7：（53.05±6.31） h比（54.33±6.37） h，t8：（55.35±6.89） h比（56.31±6.41） h］，差异均有统计学意义( P均<0.05)；细胞周期s2差异无统计学意义，在细胞周期同步性比较中，cc2 ［(9.71±4.60） h比（10.33±4.28) h］差异有统计学意义，Cook组具有更长的细胞周期，细胞发育时间间隔t5-t4 [(10.60±5.65) h比(11.20±5.90) h]、t8-t4 [(18.45±5.76) h比(19.28±5.18) h]，差异均有统计学意义( P均<0.05)，然而t2、t4-t2差异无统计学意义。两种胚胎培养试剂胚胎发育潜能比较显示，Cook组胚胎利用率(59.9%)、第3日（D3）优质胚胎率(65.4%)高于Vitrolife组(63.9%， P=0.017；69.5%， P=0.011)；两组种植率、胚胎种植率、囊胚种植率、受精率、卵裂率差异均无统计学意义（ P均>0.05）；临床妊娠率、持续妊娠率、流产率、分娩率、活产率、胎儿畸形率、活产男女比例、胚胎妊娠率、囊胚妊娠率组间比较差异均无统计学意义（ P均>0.05）。 结论:各中心应根据本中心的实际情况，摸索出适合本中心的胚胎培养试剂的胚胎时间动力学参数，制定符合最佳胚胎培养试剂选择标准，提高本中心患者临床妊娠率及活产率。

目的:探究孕期血管紧张素Ⅱ1型受体自身抗体（angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibody，AT1-AA）暴露对胎鼠肝脏发育的影响。方法:将36只10周龄健康Sprague-Dawley孕鼠随机分为对照组和AT1-AA组，每组各18只，分别于孕13 d和15 d鼠尾静脉注射生理盐水0.5 ml或AT1-AA 20 μg/g。孕12 d、14 d、16 d、18 d采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测各组孕鼠血清AT1-AA浓度、尾套法测量血压。于孕14 d、16 d、18 d分别处死孕鼠，从每只孕鼠取出2 ~3只胎鼠进行称量，计算胚胎重量、胎鼠肝脏重量和胎鼠肝脏重量/胚胎体重比值，免疫组织化学染色法检测胎鼠肝脏血浆白蛋白（Albumin）、细胞生长因子受体（c-Kit）蛋白表达，以及RNA转录组测序（RNA sequencing，RNA-seq）。体外培养HepG2细胞，分为溶剂对照组、AT1-AA处理细胞组和AT1-AA+氯沙坦处理细胞组，CCK8试剂盒检测AT1-AA对HepG2细胞活力的影响。采用独立样本 t检验、单因素方差分析对数据进行统计学分析。 结果:（1）孕16 d、18 d，AT1-AA组孕鼠血压显著高于对照组［（116.17±9.87）与（98.50±8.75）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）、（125.00±9.80）与（99.43±11.76）mmHg， t值分别为3.28和4.09， P值均<0.05］。孕14 d、16 d、18 d，AT1-AA组血清AT1-AA高于对照组（1.44±0.09与0.45±0.09、2.03±0.09与0.47±0.06、2.28±0.08与0.42±0.08， t值分别为19.20、21.64和38.68， P值均<0.05）。提示AT1-AA组孕鼠造模成功。（2）孕14 d、16 d、18 d，AT1-AA组胚胎重量与同期对照组相比均明显降低［（248.27±19.63）与（263.12±16.22）mg、（626.83±167.49）与（788.96±32.25）mg、（841.43±57.57）与（966.73±33.68）mg， t值分别为2.18、3.43和6.20， P值均<0.05］。孕16 d、18 d，AT1-AA组胎鼠肝脏重量较同期对照组显著降低［（46.97±14.00）与（73.75±6.55）mg、（60.56±7.11）与（91.75±6.19）mg， t值分别6.28和10.94， P值均<0.05］；AT1-AA组胎鼠肝脏重量/胚胎重量的比值较同期对照组显著降低［（7.45±0.70）%与（9.34±0.64）%、（7.14±0.84）%与（9.45±0.76）%， t值分别为7.47和6.82， P值均<0.05］。（3）孕14 d、16 d，AT1-AA组胎鼠肝脏中Albumin相对表达量均较对照组显著下降［（20.13±2.61）%与（28.39±3.64）%、（11.69±1.21）%与（15.23±1.07）%， t值分别为28.39和5.37， P值均<0.05］。孕14 d、16 d、18 d，AT1-AA组胎鼠肝脏中c-Kit表达相对量较对照组明显升高［（29.82±2.46）%与（24.34±1.89）%、（28.26±1.98）%与（22.52±1.98）%、（21.51±2.71）%与（11.73±2.75）%， t值分别为4.34、5.02和6.21， P值均<0.05］。（4）CCK8检测结果显示：AT1-AA处理细胞组细胞存活率较溶剂对照组显著下降［（77.54±3.64）%与（99.92±0.15）%， q=8.564， P<0.05］，AT1-AA+氯沙坦处理细胞组细胞存活率较AT1-AA处理细胞组明显上升［（96.72±8.29%）， q=7.337， P<0.05］。（5）RNA-seq结果显示AT1-AA组差异表达基因在细胞分化通路富集，分化相关信号通路呈下调趋势。 结论:孕期AT1-AA暴露会导致胎鼠肝脏中肝母细胞数量减少、造血干细胞数量增加以及胎鼠肝脏分化相关基因的下调，从而抑制胎鼠肝脏发育。

目的 探讨达格列净对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的心肌细胞肥大反应和凋亡的影响.方法 分离培养原代大鼠乳鼠心肌细胞,将其随机分为4组:对照组,Ang Ⅱ组、达格列净1组(0.5 μmol/L),达格列净2组(2 μmol/L).采用α-actin染色检测细胞面积,采用qPCR检测胚胎基因的转录,采用Tunel染色检测细胞凋亡水平,采用caspase3试剂盒检测caspase3活性,采用免疫印迹检测经典信号分子.结果 Ang Ⅱ组细胞面积明显大于对照组(P＜0.05);达格列净1组、达格列净2组细胞面积低于Ang Ⅱ组(P＜0.05).qPCR结果显示Ang Ⅱ组胚胎基因转录明显高于对照组(P＜0.05);达格列净1组,达格列净2组胚胎基因转录低于Ang Ⅱ组(P＜0.05).tunel染色结果显示:Ang Ⅱ组细胞凋亡数量高于对照组(P＜0.05);达格列净1组,达格列净2组细胞凋亡数量低于Ang Ⅱ组(P＜0.05).Ang Ⅱ组细胞caspase3活性高于对照组(P＜0.05);达格列净1组,达格列净2组细胞caspase3活性低于Ang Ⅱ组(P＜0.05).免疫印迹检测结果显示Ang Ⅱ组细胞胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)和Akt激活程度低于对照组(P＜0.05);达格列净1组,达格列净2组细胞IGF1R和Akt激活高于Ang Ⅱ组(P＜0.05).结论 达格列净可直接作用于心肌细胞,保护其免受Ang Ⅱ诱导的损伤.

目的 探究不同的保存方式对开封后体外受精(IVF)实验室试剂潜在胚胎毒性的影响.方法 收集2022年7-10月于广州市妇女儿童医疗中心生殖医学中心常规精液分析且各项参数正常的废弃精子标本18份.将待检测的开封后卵母细胞及胚胎处理液(G-MOPS)、洗精受精液(G-IVF)、卵裂胚培养液(G-1)、囊胚培养液(G-2)试剂每种分为3组,Ⅰ组:取1/3体积待测试剂在无菌条件下分装并用封口胶密封;Ⅱ组:取1/3体积待测试剂在无菌条件下分装不用封口胶密封;Ⅲ组:余下1/3体积待测试剂不分装用封口胶密封,每组6份标本.每种试剂的3组均于4℃保存,在开封时及开封15、30 d时,以质控合格的前一批次G-IVF为对照,所有试剂平衡过夜后进行人精子存活试验(HSMA),72 h后计算并比较精子存活指数.结果 开封时各组试剂的精子存活指数比较差异均无统计学意义(P均＞0.05),且3个时间段每组试剂精子存活指数均＞0.85.开封15d各组试剂的精子存活指数比较:G-1的 Ⅰ 组＞Ⅱ 组[(95.82±0.58)％vs.(94.38±0.64)％],4 种待测试剂 G-MOPS、G-IVF、G-1、G-2 的 Ⅰ 组＞Ⅲ组[(95.75± 0.48)％vs.(93.90±0.74)％、(97.25±0.67)％vs.(95.03±0.58)％、(95.82±0.58)％vs.(92.75±0.86)％、(93.92±0.74)％vs.(91.11±1.15)％],差异均有统计学意义(P均＜0.05).开封30d各组试剂的精子存活指数比较:G-IVF、G-1、G-2的Ⅰ 组＞Ⅱ 组[(97.00±0.61)％vs.(95.72±0.70)％、(95.05±0.81)％vs.(93.33±0.69)％、(93.45±0.67)％vs.(92.22± 0.85)％],4 种待测试剂 G-MOPS、G-IVF、G-1、G-2 的 Ⅰ 组＞Ⅲ组[(94.88±0.83)％vs.(92.90±0.62)％、(97.00±0.61)％vs.(94.18±0.58)％、(95.05±0.81)％vs.(92.10±0.61)％、(93.45±0.67)％vs.(90.32±0.51)％],差异均有统计学意义(P均＜0.05).结论 无论哪组试剂开封后在4℃保存30 d仍无潜在的胚胎毒性.相同时间点,开封后的试剂分装并用封口胶密封的保存效果更好.

目的 利用危重病多发性神经病(CIP)患者皮肤成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPS)系,并诱导其分化为神经细胞,为研究CIP神经细胞损害机制及治疗筛选提供细胞模型基础.方法 选取临床诊断明确的CIP患者,收集患者皮肤组织,分离出皮肤成纤维细胞,对所得细胞进行原代培养,采用Millipore慢病毒转染试剂盒,将含有Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc四个基因组合的慢病毒载体转染CIP患者皮肤成纤维细胞,诱导出患者来源的iPS.并采用碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、实时定量逆转录PCR、畸胎瘤成瘤等实验对诱导的iPS进行全能性鉴定,通过抑制SMAD信号通路诱导iPS分化为神经细胞.结果 培养的iPS镜下观察表现为人胚胎干细胞样克隆形态生长,碱性磷酸酶染色阳性,iPS细胞系的内源多能基因Sox2、REX1、NANOG和OCT4基因相对表达水平远远高于它们在初始的成纤维细胞中的表达水平(t值分别为-9.020、-10.753、-13.295、-12.677,P＜0.01),且iPS高表达人胚胎干细胞标志性蛋白,移植到免疫缺陷型小鼠模型体内能够形成畸胎瘤,并具有向三胚层分化的特点,验证本实验建立的iPS具有全能性,并可成功诱导分化为胆碱能神经元.结论 成功建立了CIP患者iPS细胞系,该iPS细胞系可成功分化为胆碱能神经元,可为CIP的发病机制研究和临床治疗探索提供良好的细胞模型.