目的:探讨汉黄芩素(WOG)通过核因子E2相关因子2(NRF2)/血红素加氧酶1(HO-1)信号途径诱导胶原诱导性关节炎大鼠成纤维细胞样滑膜细胞(大鼠CIA-FLS细胞)铁死亡的机制.方法:将大鼠CIA-FLS细胞分为:对照组、低、中、高剂量(25、50和100 μmol/L)汉黄芩素组、铁死亡抑制剂(LIP-1)组、LIP-1+高剂量汉黄芩素组、HO-1激动剂钴原卟啉(COPP)组和COPP+高剂量汉黄芩素组,CCK-8法检测细胞活力;结晶紫染色法检测细胞形态;检测氧化应激标志物谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)的含量,Western blot检测Kelch样ECH关联蛋白1(KEAP-1)、NRF2和HO-1蛋白表达水平.结果:与正常对照组相比,给予WOG处理后,大鼠CIA-FLS细胞活力显著下降(P<0.01),氧化应激水平显著上升(P<0.01),ROS含量显著增加(P<0.01),NRF2和HO-1蛋白表达水平显著下降(P<0.01),KEAP-1水平显著增加(P<0.01);与WOG组相比,LIP-1处理组的细胞活力显著上升(P<0.01),氧化应激水平显著下降(P<0.01),ROS含量显著减少(P<0.01);与WOG组相比,加入COPP后,NRF2和HO-1蛋白表达水平显著上升(P<0.01),KEAP-1水平显著下降(P<0.01).结论:WOG能通过NRF2/HO-1信号途径,促进氧化应激来诱导大鼠CIA-FLS细胞铁死亡.

基于网络药理学和细胞功能实验研究国医大师经验方蠲痹强骨方(JBQGF)治疗类风湿关节炎(RA)的潜在分子作用机制.通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、中医药百科全书数据库(ETCM)等获取JBQGF的主要活性成分和作用靶点,对核心靶点进行功能富集分析以及信号通路分析,采用Cytoscape 3.6.0 构建JBQGF的"活性成分-靶点-信号通路"的可视化网络.通过筛选获得JBQGF潜在作用通路 9 条,主要包括G蛋白偶联受体信号通路、酪氨酸激酶受体的信号传导通路等.结合课题组前期通过单细胞测序发现FGFR1 信号通路在RA活动期滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)中高度活化,通过细胞及动物实验证实抑制成纤维细胞生长因子受体 1(fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)信号通路可以明显减轻CIA大鼠关节炎症及关节破坏.随后聚焦于酪氨酸激酶受体信号传导通路,对其进一步靶基因分析发现FG-FR1 可能是JBQGF治疗RA的潜在靶点.通过Western blot实验、Transwell侵袭实验以及血管翳骨片侵蚀实验初步验证了JBQGF抑制FGFR1 的磷酸化而发挥生物学效应,进而抑制基质金属蛋白酶 2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)和NF-κB配体受体激活因子(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)从而抑制RA成纤维细胞的侵袭,抑制血管翳的骨片侵蚀效应,为进一步通过网络药理学方法寻找治疗RA潜在的靶点和中医药治疗药物提供了思路.

目的 探讨瑞香素(DAP)对TNF-α诱导的CIA大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)炎症反应的影响,阐明瑞香素调节NF-κB信号通路减轻炎症反应的分子机制.方法 将FLS细胞分为FLS组,Model组,DAP组,TP组;采用免疫蛋白印迹法、免疫荧光染色法检测P65,P-P65在CIA大鼠FLS内的蛋白表达及定位情况;采用Real-Time PCR、酶联免疫吸附法检测各组细胞相关炎症因子的mRNA相对表达量及上清中的含量.结果 DAP组中P-P65蛋白相对表达量显著低于Model组(P＜0.05);同时DAP组中P-P65的荧光强度较Model组明显减弱;DAP组中IL-6,TGF-β,ICAM-1的mRNA相对表达量和细胞上清分泌水平明显低于Model组(P＜0.05),而IL-10的mRNA相对表达量和细胞上清分泌水平明显高于Model组(P＜0.05).结论 TNF-α可诱导FLS细胞中NF-κB信号通路活化,瑞香素可降低NF-κB信号通路中P65的磷酸化水平,调节相关炎症因子的分泌,减少炎症反应.

目的 研究白花丹醌对脂多糖(LPS)诱导的体外培养CIA大鼠成纤维样滑膜细胞(CIA-FLS)的增殖及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和基质金属蛋白酶-3(MMP-3)表达的影响.方法 采用Ⅱ型胶原蛋白+弗氏完全佐剂建立大鼠关节炎模型(CIA);原代培养CIA-FLS,MTT法检测药物对CIA-FLS增殖的影响;随机设立CIA对照组、 LPS对照组、甲氨蝶呤组、白花丹醌1.0 μmol/L组、白花丹醌1.5 μmol/L组、白花丹醌2.0 μmol/L组;各药物与细胞共同孵育48 h后,ELISA法检测细胞培养上清液中TNF-a、 IL-1β和MMP-3的含量;Western blot检测细胞内MMP-3的蛋白含量.结果 MTT显示,白花丹醌能不同程度抑制 CIA-FLS的增殖,呈浓度和时间依赖性;与LPS对照组比较,甲氨蝶呤或白花丹醌均能明显下调细胞培养上清液中TNF-α、 IL-1β和MMP-3的含量(P<0. 001),明显降低细胞中 MMP-3的蛋白含量(P<0.001).结论 白花丹醌能抑制 CIA-FLS的增殖,并能通过下调TNF-α、IL-1β和MMP-3的表达而抑制LPS诱导CIA-FLS的炎症反应.

目的 研究蒙药森登4汤抑制胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠骨破坏作用机制及对滑膜成纤维细胞(FLS)体外增殖的影响.方法 本研究首先利用牛Ⅱ型胶原建立SD大鼠CIA模型,造模成功后随机分为模型组、雷公藤多苷组和蒙药森登4汤高、中、低剂量组,各10只;正常组10只大鼠不造模.各组大鼠给予相应药物,观察各组大鼠踝关节组织病理学改变,检测各组大鼠血清白细胞介素1 (IL-1)、IL-6、IL-17、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等细胞因子含量,检测Wnt信号通路关键因子DKK1蛋白在爪关节中的表达.随机取1只CIA大鼠分离FLS行体外培养,实验分为空白对照组、雷公藤多苷组及高、中、低剂量蒙药森登-4汤含药血清组,干预24、48、72 h后检测CIA-FLS增殖情况.结果 各用药组大鼠滑膜增生、细胞浸润及骨破坏评分较模型组均有不同程度下调,其中雷公藤多苷组和蒙药森登4汤高剂量组下调最为明显[(1.10±0.57)、(1.20±0.42)分比(2.80±0.42)分;(1.10±0.88)、(1.10±0.32)分比(2.90±0.32)分;(0.90±0.57)、(1.30±0.48)分比(2.70±0.48)分](均P＜0.01).各用药组大鼠血清IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α水平和爪关节DKK1蛋白表达水平与模型组比较均有所下降.高、中剂量蒙药森登-4汤含药血清组和雷公藤多苷组干预24、48、72 h后,以及低剂量蒙药森登4汤含药血清组干预48、72 h后,均可明显抑制CIA-FLS增殖,与空白对照组比较差异均有统计学意义(均P ＜0.05).结论 蒙药森登-4汤对CIA大鼠具有明显的骨破坏抑制作用,对CIA-FLS体外增殖有明显抑制作用,其作用存在量效关系,蒙药森登4汤高剂量作用优于中剂量和低剂量.

目的 通过研究薯蓣皂苷(Dio)对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的CIA大鼠成纤维样滑膜(FLS)细胞环氧合酶1(COX1)、环氧合酶2(COX2)表达的影响,探索Dio对TNF-α诱导的CIA大鼠FLS细胞的治疗作用.方法 应用TNF-α刺激CIA大鼠FLS细胞,采用MTT法检测FLS细胞活性.对TNF-α刺激的CIA大鼠FLS细胞给予不同浓度(1、2、3、4μg·mL-1)的Dio处理24 h,采用Q-PCR检测FLS细胞COX1和COX2 mRNA的表达,West-ern blot检测细胞COX2蛋白的表达.结果 浓度为3μg·mL-1的Dio作用于FLS细胞,存活率接近50％,因此用药组浓度确定为1、2、3、4μg·mL-1.TNF-α诱导后,COX1 mRNA、COX2 mRNA和COX2蛋白表达均显著升高(P<0.01).与TNF-α组相比,Dio≤3μg·mL-1时,均能不同程度地降低细胞中COX2 mRNA和蛋白的表达(P<0.05或P<0.01),Dio≥3μg·mL-1能显著抑制COX1 mRNA的表达(P<0.05或P<0.01).结论 Dio通过抑制COX2 mRNA和蛋白的表达,达到治疗TNF-α诱导的CIA大鼠FLS细胞的作用.

目的 研究温化蠲痹方对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)微小RNA-146a(miRNA-146a)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、白细胞介素-1受体相关激酶1(IRAK1)基因表达的影响.方法 选用雌性Wistar大鼠70只,按随机数字表法分为正常组(10只,生理盐水每天1 次)和造模组(60只).造模组采用尾部皮内多点注射牛Ⅱ型胶原乳剂的方法进行免疫,建立CIA模型.造模成功后(40只)用随机数字表法分为温化蠲痹方组(中药组,温化蠲痹方每天22.9 g/kg,每天1次灌胃)、模型组(生理盐水2 mL每天1次灌胃)、甲氨蝶呤组(MTX组-MTX混悬液每周0.78 mg/kg,每周1次灌胃)和温化蠲痹方加MTX组(中药加西药组,灌胃药物同中药组及MTX组),每组10只.采用容积法(排水体积)和计分法分别评价足趾肿胀度和关节炎症程度.治疗30天后处死大鼠,取各组膝关节滑膜,运用HE染色,光镜下观察大鼠滑膜病理;采用5级评分法评定滑膜炎细胞浸润和滑膜细胞增生的程度;运用实时荧光定量PCR检测滑膜中miRNA-146a、TRAF6、IRAK1基因表达水平.结果 与正常组比较,模型组大鼠足趾肿胀明显,滑膜炎性细胞浸润和增生程度明显(P＜0.05);模型组miRNA-146a、TRAF6、IRAK1基因表达明显升高(P＜0.01).与模型组比较,中药组、MTX组、中药加西药组足趾肿胀明显减轻,关节滑膜炎性细胞浸润和增生程度显著减轻,miRNA-146a、TRAF6、IRAK1基因表达明显降低(P＜0.05).与MTX组比较,中药加西药组miRNA-146a、TRAF6、IRAK1基因表达更低(P＜0.05).结论 中药温化蠲痹方可能通过抑制成纤维样滑膜细胞miRNA-146a、TRAF6、IRAK1基因表达从而抑制CIA大鼠成纤维样滑膜细胞增生,发挥其抗炎作用.MTX加用温化蠲痹方比单纯MTX治疗效果更好.

目的:观察瘀血痹片对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠的干预作用并探索抗炎相关机制.方法:建立大鼠CIA模型,给药组和阳性药组分别灌胃给予低、中、高剂量瘀血痹片(0.1,0.2,0.4g·kg-1)和甲氨蝶呤(0.4 mg·kg-1),每3d检测发病率、机械痛敏阈值及冷刺激痛敏;给药30 d后取材,外周血检测血小板计数(PLT)及纤维蛋白原(FIB)含量;苏木素-伊红染色法分析CIA大鼠关节组织病理变化;免疫组化法(IHC)和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测CIA大鼠关节组织中白细胞介素(IL)-1β,IL-8,核转录因子-κB(NF-κB)p65,磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65),大鼠肉瘤(Ras)及Raf-1蛋白表达情况.此外,采用10μg·L-1的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导人类类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS),转移小室法检测RA-FLS迁移及侵袭能力.Western blot检测RA-FLS中Ras,Raf-1,p-NF-KBp65蛋白表达水平.结果:与正常组比较,CIA模型组发病率升高,机械痛阈值明显降低(P＜0.05,P＜0.01),冷刺激反应评分显著增高(P＜0.01),外周血中PLT和FIB含量,大鼠关节组织病理评分,RA-FLS迁移和侵袭细胞个数及炎性相关因子的表达水平均显著升高(P＜0.01);与模型组比较,瘀血痹片低、中、高剂量组均能降低CIA大鼠发病率,提高其机械痛阈值并降低冷刺激痛敏反应评分(P＜0.05,P＜0.01);降低CIA大鼠外周血中PLT和FIB含量(P＜0.05,P＜0.01),改善关节滑膜增生、骨及软骨破坏等病理变化(P＜0.05,P＜0.01),并抑制RA-FLS的迁移及侵袭.此外,瘀血痹片低、中、高剂量组均能不同程度地著抑制CIA大鼠关节组织中IL-1β,IL-8,Ras,Raf-1和p-NF-κB p65的含量,以及RA-FLS细胞中Ras,Raf-1及p-NF-κBp65等蛋白表达水平(P＜0.05,P＜0.01).结论:瘀血痹片具有降低大鼠CIA发病率、关节炎临床症状和改善关节组织病理变化、抑制滑膜生成等作用,并且这一作用可能与其对Ras/Raf-1/NF-KB信号通路的抑制有关.

目的 探讨复方夏天无片对胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)小鼠的疗效及安全剂量.方法 将CIA小鼠随机分为6组:模型组、正常组、阳性(雷公藤15 mg·kg-1)组、复方夏天无片低、中、高剂量(288,864,1728 mg·kg-1)组,每组10只.治疗21d后,比较各组小鼠的一般情况、关节病理情况.探索复方夏天无片的安全浓度及对TNF-α诱导下的滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)增殖程度的影响.结果 与模型组比较,各给药组小鼠足爪肿胀情况明显减轻,复方夏天无片中、高剂量组关节炎指数显著降低(P＜0.05或P＜0.01).病理上,复方夏天无片可减少炎性细胞浸润,降低TNF-α表达,抑制破骨细胞形成,且复方夏天无片中、高剂量组优于阳性组.复方夏天无片安全浓度≤200 μg·mL-1,与模型组比较,复方夏天无片高剂量组可明显抑制FLS细胞增殖(P＜0.05).结论 复方夏天无片可改善CIA小鼠的一般情况,降低关节炎指数及TNF-α阳性表达,抑制破骨细胞形成及FLS增殖.

目的 探讨有机阴离子转运蛋白1(OAT1)对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)吸收甲氨蝶呤(MTX)以及对其增殖和迁移的影响.方法 对CIA大鼠FLS使用转染技术上调OAT1的表达,并用Western blot、RT-qPCR方法验证转染效率.将FLS分为阴性对照组(NC组)、Overexpress组,并用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(20 ng/ml)刺激.另取正常大鼠FLS为对照组(Control),给予同浓度(100 ng/ml) MTX和OAT1特异性底物对氨基马尿酸(PAH),采用UPLC-MS/MS方法评估FLS对MTX及PAH吸收功能.给予MTX(100 ng/ml)后使用CCK-8、Transwell方法检测FLS增殖效应及迁移能力.结果 与NC组相比,Overexpress组的OAT1及Slc22a6表达均上升;与NC组比较,OAT1过表达组FLS对MTX和PAH的吸收在15、30、45、60、120 min时均增加;与NC组比较,Overexpress组FLS的增殖效应在12 h时下降,并趋近于Control组水平;与NC组比较,12 h时OAT1过表达组的迁移能力下降,并趋近于Control组水平.结论 OAT1表达的升高能增加炎性FLS对MTX的吸收,并可抑制其异常的增殖效应和迁移能力.