目的:探讨美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏对肝癌耐5-氟尿嘧啶细胞(BEL-7402/5-FU)自噬和转移侵袭能力的影响.方法:以肝癌敏感细胞BEL-7402和肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU作为实验对象,给予索拉菲尼、CⅡ-3和脱脂膏处理,检测自噬标志蛋白的生成,同时检测细胞中自噬相关因子和侵袭转移相关因子的水平以及细胞侵袭转移能力的变化.结果:耐药细胞组中p62蛋白低表达,给予阳性药索拉菲尼、CⅡ-3和脱脂膏后,细胞中p62蛋白表达量明显升高.和敏感细胞相比,耐药细胞中LC3B生成增多,给予CⅡ-3后LC3B生成减少.CⅡ-3和脱脂膏给药组均能明显抑制自噬和侵袭转移的部分相关因子的表达,包括降低ATG5、PIK3C3、BECLIN、LC3B、MMP-9、Akt、4EBP1 mRNA表达.划痕试验结果显示,相比于敏感细胞,耐药细胞具有更强的侵袭转移能力,给予索拉菲尼和CⅡ-3作用后均可显著抑制细胞的侵袭转移,而脱脂膏则无显著的抑制效果.结论:肝癌耐药细胞具有很强的自噬和侵袭转移能力,而美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏体外均能明显抑制耐药细胞的自噬和侵袭转移,但仅能影响部分相关因子.

目的 研究美洲大蠊提取物CII-3 和脱脂膏对肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU自噬和侵袭转移的影响以及初步的作用机制.方法 对接种肝癌敏感细胞BEL-7402 和肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU的移植瘤裸鼠,通过索拉菲尼、CII-3 和脱脂膏药物处理后,观察给药后裸鼠血清生化指标,裸鼠瘤块变化和心、肝、肾、脾等脏器指数的变化,以及肝脏和瘤块病理学改变,同时观察肿瘤组织细胞中的自噬相关因子和侵袭转移相关因子的变化.结果 CII-3 和脱脂膏能使裸鼠体重呈下降趋势,并抑制肿瘤的生长,明显减轻瘤重(P<0.01);CII-3 能提高脾脏指数和心脏指数(P<0.05);与耐药组相比,CII-3 组裸鼠血清CR有升高趋势(P<0.05);索拉菲尼和CII-3 处理组能诱导肿瘤组织坏死,作用优于脱脂膏组;与耐药组相比,除AKT外(P>0.05),CII-3和脱脂膏给药组均能明显抑制自噬和侵袭转移相关因子(P<0.05).结论 美洲大蠊提取物CII-3 和脱脂膏均能抑制肝癌耐药细胞的自噬和侵袭转移,同时具有较好的抑瘤作用.其对裸鼠肝癌移植瘤的肝肾损伤有待进一步观察.

目的:探讨美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用.方法:通过小鼠腋窝皮下注射H22肝癌小鼠腹水构建荷瘤小鼠模型.将70只小鼠随机分为模型组(生理盐水)、5-氟尿嘧啶组(阳性药对照,20 mg/kg)以及美洲大蠊提取物的脱脂膏组(200 mg/kg,以提取物量计)、CⅡ-3组(从浸膏中提取的以多肽为主要活性成分的组分,200 mg/kg,以提取物量计)和多肽PAP-2高、中、低剂量组(从CⅡ-3中分离得到,200、100、50 mg/kg,以单体量计),每组10只.5-氟尿嘧啶组小鼠隔天腹腔注射给药1次,其余各组小鼠均每天灌胃给药1次,给药周期均为10 d.给药结束后,观察小鼠瘤块变化并测定其脏器(脾、胸腺、肝)指数,苏木精-伊红染色后观察其瘤组织病理变化,并采用酶联免疫吸附试验法测定其血清中血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-4的含量.结果:脱脂膏、CⅡ-3和不同剂量的PAP-2均能不同程度地抑制荷瘤小鼠瘤块的生长并升高其脏器指数,且PAP-2的作用具有一定的量效关系.其中,PAP-2高剂量组的抑瘤率(38.95％)显著高于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05),并与5-氟尿嘧啶组(40.87％)接近(P>0.05);PAP-2高剂量组小鼠脾指数、胸腺指数、肝指数较模型组均显著升高(P<0.05),并显著高于CⅡ-3组(P<0.05),且其肝指数显著高于脱脂膏组(P<0.05).此外,PAP-2还可降低荷瘤小鼠血清中VEGF和IL-4含量、升高其血清中IL-1β含量,其中PAP-2高剂量组与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05);并且PAP-2高剂量组小鼠血清中IL-1β含量显著高于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05),IL-4含量显著低于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05),但是其血清中VEGF含量显著低于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05).结论:美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用,可升高其脏器指数,降低其血清中VEGF、IL-4含量并升高其血清中IL-1β含量.

目的:探讨美洲大蠊多肽对血管生成的作用,探讨其机制.方法:以人脐静脉内皮细胞HUVECs和人肝癌HepG2细胞为研究对象,采用噻唑蓝(MTT)比色法和细胞划痕实验,观察不同质量浓度(6.25,12.5,25,50,100 mg·L-1)的美洲大蠊多肽(PAP-1 ～3),脱脂膏和美洲大蠊多肽前体物CⅡ-3对HUVECs增殖、迁移的影响,另设正常组和沙利度胺组;采用小管形成实验检测各组HUVECs小管形成能力;通过细胞间黏附实验,观察不同质量浓度(25,50,100 mg·L-1)的美洲大蠊提取物处理后人肝癌HepG2细胞同HUVECs之间黏附能力;利用免疫细胞化学染色和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测各组HUVECs中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达.结果:MTT比色法结果显示,多肽均能抑制HUVECs的增殖(P＜0.05),呈剂量依赖关系.不同质量浓度多肽分别作用24,48,72 h,PAP-2的抑制作用优于PAP-1,PAP-3 (P ＜0.05).不同质量浓度的CⅡ-3和脱脂膏作用,HUVECs的存活率明显升高.细胞划痕实验结果显示多肽均能抑制HUVECs迁移(P＜0.05),且随药物浓度的增加,抑制迁移的作用也越强.其中PAP-2的作用优于PAP-1和PAP-3(P＜0.05);CⅡ-3在一定程度上能抑制HUVECs迁移,但是剂量越大,抑制作用越弱;脱脂膏作用后,HUVECs迁移能力增强.小管生成实验结果显示,多肽均能抑制HUVECs小管形成(P＜0.05),且随着给药浓度的增大,抑制作用越强.其中,PAP-2对小管形成的抑制作用优于PAP-1和PAP-3(P＜0.05).CⅡ-3和脱脂膏一定程度上促进HUVECs小管的形成.细胞间黏附实验结果显示,多肽均能阻断HepG2同HUVECs之间的黏附(P＜0.05),其中PAP-2对HepG2同HUVECs间黏附的阻断作用强于PAP-1和PAP-3 (P ＜0.05).相反,CⅡ-3和脱脂膏在一定程度上却能促进HepG2同HUVECs间黏附.免疫细胞化学染色和ELISA实验结果显示,多肽均能够下调HUVECs细胞中VEGF含量(P＜0.05),且呈浓度依赖性.其中,PAP-2对VEGF的下调作用优于PAP-1和PAP-3(P＜0.05).而CⅡ-3和脱脂膏能上调HUVECs中VEGF的表达.结论:美洲大蠊多肽对HUVECs的侵袭和转移,分化形成小管的能力有一定抑制作用,并能下调细胞中VEGF蛋白的表达.其中,美洲大蠊多肽的作用优于CⅡ-3和脱脂膏,多肽中PAP-2的作用较优.

目的:优选美洲大蠊脱脂膏酶解工艺的最佳水解酶,以提高美洲大蠊中抗肝纤维化活性部位的提取得率和活性.方法:以美洲大蠊脱脂膏为对照,采用茚三酮法和福林酚法考察胰蛋白酶(TR)、胃蛋白酶(PE)、碱性蛋白酶(AL)、木瓜蛋白酶(PA)、中性蛋白酶(NE)对脱脂膏的水解度;采用大孔树脂分离纯化法,分别以50％、60％、70％、95％乙醇为洗脱溶剂,考察各酶解液不同溶剂洗脱部位的得率;借助大鼠肝星状细胞HSC-T6体外抑制试验,考察各酶解液洗脱部位的抗肝纤维化活性.结果:PA、NE对美洲大蠊脱脂膏的水解度分别为14.15％、15.70％,具有较强的酶解能力.PA、NE、AL酶解液的95％乙醇洗脱部位得率分别为(0.73±0.04)％、(0.65±0.01)％、(0.64±0.05)％,分别较不加酶的脱脂膏提高了30.36％、16.07％、14.29％.细胞体外抑制试验结果显示,各酶解液分离纯化所得的50％、60％、70％乙醇洗脱部位对HSC-T6细胞抑制率较低或呈现促增长现象;其95％乙醇洗脱部位对HSC-T6细胞的抑制率总体均在20％以上,其中PA、NE酶解液分离纯化所得的95％乙醇洗脱部位作用24～72 h时的半数抑制浓度(IC50)分别为94.5～112.3、117.1～120.0μg/mL,总体小于不加酶的脱脂膏的IC50(116.1～123.0μg/mL).结论:综合水解度、纯化洗脱部位得率及对HSC-T6细胞的体外抑制活性3个指标,确定PA为美洲大蠊脱脂膏抗肝纤维化活性部位酶解工艺的最佳水解酶;NE、AL效果次之;PE、TR效果较差,不适于该酶解工艺.

目的:探究美洲大蠊含药血清对人肝癌HepG2细胞的影响及可能的作用机制.方法:采用MTT法测量HepG2细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期及凋亡,酶联免疫吸附试验检测细胞上清中IFN-γ、IL-4、TNF-α的含量.结果:美洲大蠊含药血清组对肝癌HepG2细胞增殖均有不同程度的抑制作用,作用呈时间-浓度依赖性.其多肽PAP-2组的抑制率明显高于CⅡ-3及脱脂膏组,且PAP-2联用5-FU组抑制率明显高于单用PAP-2组,具协同作用.各血清组均能诱导HepG2细胞凋亡,并呈浓度依赖性,使细胞周期阻滞于S期或G2/M期.各血清组能下调IFN-γ表达,并呈浓度依赖性,并且联合5-FU用药具有协同作用;均能不同程度上调肝癌HepG2细胞IL-4、TNF-α的表达,与浓度呈负相关.结论:美洲大蠊含药血清能抑制HepG2细胞增殖,诱导HepG2细胞凋亡并抑制细胞周期的发展,且能够调节细胞因子,发挥免疫作用.

目的 优选中性蛋白酶酶解美洲大蠊脱脂膏制备抗肝纤维化活性提取物的工艺.方法 以美洲大蠊脱脂膏的水解度、活性提取物的得率和体外活性为评价指标,在单因素考察(酶用量、酶解时间、pH值、酶解温度、底物浓度)的基础上,采用L9(34)正交试验优化中性蛋白酶酶解制备抗肝纤维化活性提取物的工艺.结果 最佳酶解工艺为酶用量0.3％,酶解时间2h,pH值8.5,酶解温度45℃,底物密度1.07 g·mL-1.工艺验证试验结果表明,美洲大蠊脱脂膏的水解度为15.8％,活性提取物的得率从0.54％提高到0.72％,其24,48,72 h的IC50值分别为(118.37±3.12),(115.16±2.48),(105.00±6.35)μg·mL-1.结论 研究得到美洲大蠊抗肝纤维化活性提取物的酶解制备工艺,该工艺得率较高,简单可行,为美洲大蠊抗肝纤维化药物的研发奠定基础.

目的:研究美洲大蠊提取物脱脂膏及CⅡ-3(分别简称"脱脂膏""CⅡ-3")逆转耐阿霉素(ADM)人肝癌细胞HepG2/ADM多药耐药的作用机制.方法:采用MTT法考察不同质量浓度索拉非尼(阳性对照)、脱脂膏和CⅡ-3对HepG2/ADM细胞的毒性作用,并计算20％抑制浓度(IC20).试验设置敏感组、耐药组、索拉非尼组、脱脂膏组和CⅡ-3组,敏感组使用HepG2细胞,后4组均使用HepG2/ADM细胞.敏感组和耐药组细胞给予常规培养基,其余3组细胞给予相应药物(浓度均为IC20).采用激光扫描共聚焦显微技术测定细胞中ADM含量;采用Western blotting法测定细胞中凋亡相关蛋白[B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、剪切型胱天蛋白酶9 p37(Cleaved-Caspase-9 p37)]的表达水平;分别采用实时荧光定量-聚合酶链式反应法和免疫细胞化学染色法检测细胞中多药耐药相关基因mRNA及蛋白[P-糖蛋白(P-gp)(MDR1基因表达产物)、肺耐药蛋白(LRP)、乳腺癌耐药相关蛋白(BCRP)]和酶介导多药耐药途径中相关基因mRNA及蛋白[谷胱甘肽转移酶(GST-π)、DNA拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)]的表达水平.结果:索拉非尼、脱脂膏、CⅡ-3对HepG2/ADM细胞的IC20分别为(2.40±0.16)、(200.44±27.52)、(18.00±1.82)μg/mL.与敏感组比较,耐药组细胞中Bcl-2、P-gp、LRP、BCRP、TopoⅡ蛋白表达水平以及MDR1、LRP、BCRP、GST-πmRNA表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01).与耐药组比较,脱脂膏组和CⅡ-3组细胞中ADM含量显著增加(P<0.05或P<0.01),MDR1 mRNA表达水平和LRP、BCRP、GST-πmRNA及其蛋白表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01);CⅡ-3组细胞中Bcl-2蛋白表达水平、TopoⅡmRNA表达水平均显著降低(P<0.01),Cleaved-Caspase-9 p37蛋白表达水平显著升高(P<0.05).结论:脱脂膏、CⅡ-3可通过减少药物外排、促进细胞凋亡、减少多药耐药相关基因和酶介导多药耐药途径中相关基因的mRNA及其蛋白的表达等方式,逆转HepG2/ADM细胞的多药耐药性,且CⅡ-3的效果优于脱脂膏.

目的:探讨美洲大蠊多肽PAE2体内逆转肝癌多药耐药(MDR)的作用及机制.方法:采用Balb/c-nude小鼠腋下接种HepG2和HepG2/ADM细胞分别建立肝癌敏感株动物模型和肝癌MDR动物模型,模型制备成功后,将裸鼠随机分为正常组,HepG2模型组,HepG2/ADM模型组,索拉菲尼组[30mg·kg-1,灌胃(ig)],HepG2/ADM+PAE2[静脉注射(iv)]低、中、高剂量组(50,100,200 mg·kg-1),HepG2/ADM+PAE2ig低、中、高剂量组(50,100,200 mg·kg-1),脱脂膏组(200 mg·kg-1,ig),美洲大蠊前期粗提物CⅡ-3组(200 mg·kg-1,ig),每2日测量1次裸鼠体质量及肿瘤体积,并记录,末次给药后,次日取裸鼠肿瘤组织,记录瘤质量,采用免疫组织化学(IHC)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)测定美洲大蠊多肽PAE2对肿瘤组织中P糖蛋白(P-gp),肺耐药相关蛋白(LRP),乳腺癌耐药蛋白(BCRP),蛋白激酶C(PKC),谷胱甘肽巯基转移酶-π(GST-π),拓扑异构酶Ⅱ (ToPoⅡ ),MDR基因1(MDR1)及MDR相关蛋白1(MRP1)蛋白水平和基因水平表达的影响.另同时设置口服和静脉2种给药组别以研究美洲大蠊PAE2的基本药代动力学特征.结果:裸小鼠体质量方面,造模成功后,与正常组比较,裸小鼠体质量明显减轻(P＜0.05),经各药物治疗后,体质量有一定回升,但仍然不及正常裸小鼠.抑瘤作用方面,与模型组比较,美洲大蠊多肽PAE2iv组中剂量组抑瘤效果最好(P＜0.05),口服给药组抑瘤作用随剂量的增加而增加,高剂量组效果最好(P＜0.05),美洲大蠊前期粗提物CⅡ-3无明显抑瘤作用,脱脂膏具有一定的抑瘤效果(P＜0.05).MDR相关蛋白和酶方面,美洲大蠊多肽PAE2在体内对MDR相关的蛋白和酶均有一定影响,主要可能通过抑制肿瘤组织内LRP,BCRP表达和不同程度影响上述相关蛋白、基因表达而抑制细胞内药物外排,从而促进肿瘤凋亡,且作用优于美洲大蠊前期粗提物CⅡ-3和脱脂膏.结论:美洲大蠊多肽PAE2可能通过影响介导MDR的相关蛋白和酶的表达,减少药物外排,促进细胞内药物累积、细胞凋亡,从而发挥逆转HepG2/ADM细胞Balb/c-nude小鼠移植瘤MDR的作用.

目的 探讨美洲大蠊多肽PAP-2对肝癌免疫微环境的影响,及其作用机制.方法 通过给昆明种小鼠注入H22细胞悬液构建Balb/c小鼠肝癌原位移植瘤模型,将原位移植瘤小鼠随机分为10组:模型组,5-氟尿嘧啶组(20 mg·kg-15-FU),美洲大蠊多肽PAP-2低、中、高剂量组(50、100、200 mg·kg-1 PAP-2),5-氟尿嘧啶(20 mg·kg-15-FU)+PAP-2低、中、高剂量组(50、100、200 mg·kg-1 PAP-2),美洲大蠊CⅡ-3组(200 mg·kg-1 CⅡ-3),脱脂膏组(200 mg·kg-1脱脂膏),5-Fu组隔天给药1次,其余各药物组每天1次,腹腔注射.通过检测抑瘤率、胸腺指数及脾指数,检测肿瘤组织中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和IL-1β的表达水平,检测小鼠脾细胞中相关淋巴细胞的变化水平.结果 模型组、5-氟尿嘧啶组、美洲大蠊多肽PAP-2高剂量组、5-FU+PAP-2高剂量组、美洲大蠊CⅡ-3组、脱脂膏组的瘤质量分别为(0.96±0.15)、(0.33±0.19)、(0.30±0.23)、(0.12±0.04)、(0.35±0.12)和(0.41±0.06)g,IL-1β含量分别为(18.93±2.68)、(28.88±1.14)、(23.20±2.79)、(24.47±1.79)、(21.65±3.09)和(21.25±2.78)pg·mL-1,TNF-α含量分别为(12.32±1.12)、(25.71±0.98)、(14.25±1.94)、(23.06±1.71)、(13.49±1.38)和(14.34±2.18)pg·mL-1,巨噬细胞比例分别为(0.94±0.64)％、(3.19±1.12)％、(3.13±1.15)％、(5.45±3.49)％、(2.03±0.59)％和(3.76±0.44)％,B细胞比例分别为(35.53±9.84)％、(61.30±2.57)％、(59.63±3.36)％、(47.20±12.61)％、(53.60±5.68)％和(54.88±4.48)％.模型组的上述指标与其余各组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05).结论 美洲大蠊多肽PAP-2能够提高肝癌原位移植瘤小鼠的免疫功能,一定程度上改善其免疫微环境.