由于工业发展以及生活废弃物污染的不断加剧,作物中的重金属浓度超标,严重威胁人体的健康.铝激活苹果酸转运体编码一类阴离子通道蛋白,在植物有机酸的跨膜转运中发挥重要的作用.为研究GmALMT33基因在大豆应对镉胁迫中的功能,本研究以大豆黑农48的叶片cDNA为模板,利用RT-PCR克隆得到GmALMT33基因.该基因CDS区全长1622 bp,编码553个氨基酸,含有1个ALMT结构域.qRT-PCR结果表明,GmALMT33在大豆根部的表达水平最高;镉胁迫后,该基因表达量呈现先升高后降低的趋势.构建植物表达载体pCPB-GmALMT33并对烟草、大豆毛状根进行遗传转化,转基因植株抗逆表型与生理指标分析表明,镉(66pmol/LCdCl2)胁迫下,转基因烟草叶片黄化、褪绿,边缘褐化程度明显低于野生型烟草.转基因大豆毛状根复合体植株茎秆和叶脉呈现的红褐色毒害症状程度明显弱于转空载体植株.在镉胁迫处理7d后,转基因烟草叶片的超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶活性及可溶性糖含量均高于野生型对照,丙二醛含量均低于对照.在镉胁迫处理0 d、1 d、3 d后,转基因大豆毛状根复合体根和叶的超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶活性、可溶性糖含量均高于转空载体对照,丙二醛含量均低于对照,表明GmALMT33基因提高了植株的耐镉能力.本研究为进一步探讨GmALMT33基因的作用机制提供了依据,并为大豆抗逆育种提供了新的基因.

程序性细胞死亡(PCD)是生物体受遗传调控的自主细胞死亡现象,在植物生长发育和抵抗环境胁迫中起重要作用.PCD的发生可受线粒体中活性氧(ROS)诱导.中国科学院遗传与发育生物学研究所李家洋研究组早期的研究发现了1个拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞死亡突变体mod1,并暗示植物细胞中存在叶绿体与线粒体之间的信号交流调控PCD,但其中的具体作用机制尚不清楚.最近,他们通过大规模筛选mod1突变体的抑制突变体,克隆了3个新的抑制基因pINAD-MDH、DiT1和mMDH1.此3个基因分别编码质体定位的NAD依赖的苹果酸脱氢酶、叶绿体被膜定位的二羧酸转运蛋白1和线粒体定位的苹果酸脱氢酶1,突变后都可抑制mod1中ROS的积累及PCD的发生.通过对这些基因进行深入的功能分析,他们论证了苹果酸从叶绿体到线粒体的转运对线粒体中ROS的产生及随后PCD的诱导起重要作用.该研究拓展了我们对植物细胞中细胞器间交流的认识,为我们深入理解植物PCD发生机制提供了新线索,是该领域的一项突破性进展.

该研究以铝(Al)敏感型黑大豆(SB)根为实验材料,通过一系列生理生化和组织化学实验手段,探讨了水杨酸(SA)通过调控内源H2S信号缓解铝胁迫的作用方式.结果表明:(1)A1C13处理黑大豆SB根系Al积累增加,AlC13与SA共处理能明显抑制Al在SB根系的累积,加入H2S清除剂(HT)或H2S合成抑制剂(PAG)后SB根系A1累积量增加.(2)SA使Al胁迫下黑大豆(SB)根内源H2S水平增加1.5倍,并显著缓解A1胁迫导致的根生长抑制、活性氧(ROS)累积、氧化损伤和细胞死亡,共处理HT或PAG均能够显著降低内源H2S水平,并可逆转上述所有SA对A1胁迫的缓解效应.(3)SA降低了A1胁迫下黑大豆(SB)根尖抗氧化酶CAT、SOD和APX活性,抑制SB根系细胞ROS的产生,用HT或PAG抑制H2S信号可增强抗氧化酶活性.(4)在A1胁迫条件下,SA可进一步上调一系列耐Al基因的表达,包括外部解毒机制中的耐铝转录因子GnART1、柠檬酸合成酶基因GmCS、柠檬酸转运蛋白基因GmMA TE,内部解毒机制中的苹果酸转运蛋白基因GmAlCT以及Ap+相关转运蛋白基因GmAlS1和GmNIP1;2,通过HT或PAG降低内源H2S水平可逆转SA对上述基因表达的调控.(5)SA可提高Al胁迫下黑大豆(SB)根柠檬酸的分泌量,此效应亦可被HT或PAG抑制.研究发现,H2S可作为SA的下游信号参与调控黑大豆(SB)响应Al胁迫的过程,为揭示植物Al耐受信号调控网络途径提供部分新的理论基础.

铝是地壳中最丰富的金属元素.在pH低于5.5的酸性土壤中,部分含铝矿物中的铝会溶解进入土壤溶液,严重危害植物的生长和发育.一些植物能够进化出耐铝机理以制抵抗铝毒害.其中,铝诱导根系分泌有机酸阴离子(包括柠檬酸、苹果酸和草酸)是证据最确凿的机理之一.分泌到胞外的有机酸阴离子可以通过螯合作用解除铝毒.编码铝诱导柠檬酸和苹果酸阴离子分泌的转运蛋白基因已被鉴定.同时,众多证据表明这些基因的表达调控与植物耐铝性密切相关.本文概述了近年来植物耐铝机理,特别是铝诱导植物根系分泌有机酸阴离子的生理机制的研究进展.重点总结了编码有机酸转运蛋白基因的鉴定,以及对这些基因表达调控的理解.本文也对调控有机酸转运蛋白基因表达的可能的信号通路作了讨论,并提出了该领域的研究展望.

ABC转运蛋白家族是一类通过结合并水解ATP释放能量实现底物的跨膜运输的转运蛋白,它们参与了植物众多的生理代谢过程,根据保守区的进化关系将ABC转运蛋白家族分成8个亚族,其中ABCB转运蛋白为第二大亚族.ABCB转运蛋白具保守的NBDs结构域,由6个跨膜α-螺旋的疏水跨膜结构域组成了TMDs结构域,形成溶质跨膜的通道,但是其结构、长度与序列则变化多样.按分子大小不同将植物ABCB转运蛋白分为全分子转运蛋白、半分子转运蛋白两类,通过测序发现在拟南芥、水稻和番茄等植物上均有一定比列的ABCB转运蛋白,且行使多种功能.有研究表明,ABCB转运蛋白基因介导镉、铅和铝等重金属离子的转运,提高植物重金属耐性;它直接参与植物体内生长素的运输,从而调控植物高度;它还可能将苹果酸从质体转运到保卫细胞中调节气孔的开合.近年来,越来越多的ABCB转运蛋白被鉴定,但是ABCB亚家族庞大,底物特异性强,转运机制复杂,多数转运蛋白的功能尚未确定.因此,了解ABCB转运蛋白在生命活动过程中的重要性,以及基因表达调控的机制,解析ABCB转运蛋白在响应逆境胁迫过程中的重要作用,以期为植物抗逆性育种提供思路.

本研究以油茶良种'华金'扦插苗根系为材料,通过RT-PCR克隆出油茶铝激活的苹果酸转运蛋白基因家族一个成员,命名为CoALMT9,该基因的编码序列长1 761 bp,编码586个氨基酸.利用ProtParam等软件进行生物信息学分析,同时通过实时荧光定量PCR和亚细胞定位对该基因的表达模式和表达部位进行分析,结果表明:CoALMT9蛋白的分子质量是66.84 kDa,理论等电点是6.57,为不稳定的非分泌蛋白;CoALMT9蛋白含5个跨膜区,二级结构以α螺旋为主.实时荧光定量PCR结果表明,铝毒(4 mmol·L-1 Al3+处理)诱导了CoALMT9在油茶根系中的表达,在铝毒条件下添加1 mmol·L-1 PO3-4能显著提高该基因表达水平.亚细胞定位分析确定CoALMT9所编码的蛋白质定位于液泡膜.该研究表明CoALMT9基因可能在油茶磷缓解铝毒过程中起作用,为揭示其适应高铝低磷环境的分子机制提供参考.

为了阐明李果实有机酸组成特征及其与苹果酸转运体基因PsALMT9、PstDT的相关性,该研究以'皇冠李'(Prunus salicina' Huangguan')和'黑琥珀李'(Prunus salicina 'Black Amber')为试材,测定了不同发育阶段果实有机酸组分与含量、可滴定酸含量、pH、单果重,采用实时荧光定量PCR (qPCR)分析了苹果酸转运体基因PsALMT9和PstDT在果实生长发育过程中的表达变化规律,并通过Pearson相关系数探讨PsALMT9和PstDT基因与果实有机酸的相关性.结果 显示:(1)'皇冠李'和'黑琥珀李'果实各发育阶段主要有机酸组分为苹果酸(占73.83％～92.10％),其次为酒石酸(占4.59％～14.26％),柠檬酸、草酸、乙酸和琥珀酸含量较低(0.47％～7.21％),富马酸仅以微量存在.(2)果实苹果酸含量与可滴定酸含量呈极显著正相关关系,与pH呈极显著负相关关系;PsALMT9表达量与酒石酸含量呈显著正相关关系,与乙酸和草酸含量呈极显著正相关关系;PstDT表达量与柠檬酸、可滴定酸含量呈显著正相关关系,但PsALMT9和PstDT均与苹果酸含量的相关性较低.研究发现,'皇冠李'和'黑琥珀李'属于苹果酸型果实,果实酸度主要由苹果酸决定;PsALMT9基因可能同时参与酒石酸、乙酸和草酸的跨液泡膜转运,PstDT基因可能参与柠檬酸的跨液泡膜转运,而苹果酸跨液泡膜转运过程可能与PsALMT9、PstDT等多种膜蛋白基因的协同调控有关.

为提高CHO细胞重组蛋白表达量,对比研究了过表达代谢相关酶丙酮酸羧化酶(PYC2)、苹果酸酶Ⅱ(MDH2)、丙氨酸转氨酶1(ALT1)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ(CPS Ⅰ)和代谢相关蛋白牛磺酸转运蛋白(TAUT)及透明颤菌血红蛋白(VHb)对ExpiCHO-S瞬时表达anti-hLAG3的影响.结果表明,过表达上述7种蛋白均能不同程度提高抗体产量.其中,过表达OTC、CPSⅠ、MDH2和PYC2分别能够使ExpiCHO-S抗体产量提高29.2％、27.6％、24.1％和20.3％.并且,过表达OTC和MDH2能够明显提高细胞培养初期的抗体生产速率,提前4d达到与对照组相近的抗体产量.过表达OTC和MDH2对anti-hLAG3对抗原的亲和力基本无影响.大多数情况下,7种蛋白对细胞生长基本无影响.此外,过表达MDH2和ALT1同样能够提高H293T细胞的抗体产量.总的来说,代谢相关蛋白的过表达可以应用于瞬时表达系统,提高哺乳动物细胞的抗体产量.

目的 以箭麻(天麻Gastrodia elata的一个生长阶段)和共生天麻(白麻与蜜环菌共生的天麻)为实验材料,通过转录组测序分析初步揭示箭麻和共生天麻生长代谢特征.方法 采用Trizol Reagent(Invitrogen)提取天麻样品中的RNA,建立测序文库并利用Illumina HiseqTM2000进行测序,通过与基因数据库比对分析注释和发现差异表达基因.结果 箭麻与共生天麻间共获得72 244条序列,其中有26 312条得到注释.在False Discovery Rate(FDR)＜0.05和|log2FC|＞1筛选条件下,共有12 498条基因发生显著差异表达,其中9000条基因表达上调,3498条表达下调.京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)功能富集分析表明,差异基因显著富集在20个代谢途径中,其中包含氮代谢,碳代谢和能量代谢等途径.差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)注释到蛋白相邻类的聚簇(cluster of Orthologous Groups of proteins,KOG)的25个分类中,其中差异表达基因与生长代谢过程相关过程能量的产生和转化(energy production and conversion,C)、碳水化合物转运与代谢(carbohydrate transport and metabolism,G)、次生代谢产物的合成、转运和代谢(secondary metabolites biosynthesis,transport and metabolism,Q)类别获得2218个注释结果.基于转录组数据,分析了生长代谢过程中相关基因差异表达水平,发现有利于碳、氮、能量等物质积累的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)、天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,ASNS)、蔗糖合成酶(sucrose synthase,SuSy)、可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase,SSS)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase,PDH),苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH),异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)基因呈上调表达,除分解ATP的ATP酶(adenosine-triphosphatase,ATPase)上调外,分解氮、碳物质的谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)、精氨酸酶(arginase,Argase)和淀粉酶(amylase,AMS)基因呈下调表达.qRT-PCR分析结果表明这些基因表达水平与转录组表达情况基本一致.相比较于箭麻,共生天麻生长代谢中物质积累比较旺盛.结论 共生天麻通过消解侵入的蜜环菌合成有机营养物质和能量,有利于其从蜜环菌和周围环境吸收营养物质供箭麻生长需要,为进一步研究天麻不同发育阶段代谢特征奠定基础,并为天麻栽培提供理论指导.

利用两个对铝胁迫耐受性表现显著差异的芝麻(Sesamum indicum)品种'金黄麻'(耐铝)和'竹山白'(铝敏感)为实验材料,进行了铝胁迫下芝麻根系的高通量RNA测序和比较转录组分析,筛选响应铝胁迫的潜在候选基因,研究芝麻响应铝胁迫的分子机制.从16个转录组测序文库共获得137.57 Gb的clean data(干净数据),平均每个样本获得8.60 Gb高质量序列.两个材料处理前和处理后的比较转录组分析中共鉴定到1425个差异表达基因在胁迫处理后的'金黄麻'中上调表达,上调差异倍数大于'竹山白',且铝胁迫后其表达水平大于'竹山白';773个基因在胁迫处理后的'金黄麻'中下调表达,下调倍数大于'竹山白',且铝胁迫后其表达水平小于'竹山白'.基因本体(GO)富集分析的结果表明这些基因主要富集在与离子结合、膜组成成分和防御刺激应答反应有关的GO条目中.京都基因和基因组数据库(KEGG)富集分析的结果显示差异表达基因主要富集在次级代谢产物的生物合成途径、苯丙素生物合成途径和植物-病原菌互作途径.多个铝激活的苹果酸转运蛋白基因和过氧化物酶基因在富集通路中被鉴定到.差异表达基因荧光定量PCR的结果表明基因表达的变化趋势与转录组测序结果基本符合.这些结果将为进一步研究芝麻耐铝的分子机制奠定基础.