目的:探究碳黑与镉（cadmium，Cd）复合暴露对人支气管上皮细胞株16HBE细胞蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）通路的影响，及其所致自噬和炎症反应的作用机制。方法:于2022年1月，复苏培养人支气管上皮16HBE细胞。将碳黑纳米颗粒（carbon black nanoparticles，CBNPs）氧化后吸附Cd 2+构建CBNPs-Cd复合物。CCK-8试验检测CBNPs与Cd不同浓度和时间组合暴露对16HBE细胞活力的影响。以2 μg/ml Cd，100 μg/ml CBNPs，100 μg/ml CBNPs+2 μg/ml Cd联合暴露24 h作为后续剂量分组。分别应用透射电镜检测自噬体和自噬溶酶体数量。蛋白免疫印迹（Western blotting）法检测PERK通路蛋白PERK、真核翻译起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIf2α）、激活转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）、自噬相关蛋白螯合体1（sequestosome 1，SQSTM1）/P62和微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAlPILC3，简称LC3）的表达。以基因沉默技术抑制PERK基因后，检测自噬标志蛋白P62、LC3的变化，使用荧光定量PCR技术检测炎症因子白细胞介素-6 （interleukin-6，IL6）、白细胞介素-8 （interleukin-8，IL8）的表达。多组比较采用单因素方差分析，组内两两之间的比较采用 LSD检验；多因素的成分分析采用析因分析。 结果:CBNPs与Cd单独/复合暴露24 h后，16HBE细胞活力变化均无统计学意义（ P>0.05）。与对照组比较，CBNPs与Cd单独/复合暴露组16HBE细胞P62和LC3表达均明显升高（ P<0.05），且复合暴露组较其他组别的自噬体和自噬溶酶体数量增加。与对照组比较，CBNPs和Cd单独暴露对p-PERK/PERK、p-eIf2α/eIf2α蛋白表达影响均无统计学意义（ P>0.05），但复合暴露组p-PERK/PERK、p-eIf2α/eIf2α、ATF4蛋白的表达均升高（ P<0.05），且CBNPs与Cd单独/复合暴露组16HBE细胞IL6、IL8水平均明显高于对照组（ P<0.05）。CBNPs-Cd复合暴露组敲低PERK基因后，LC3蛋白和IL6、IL8水平均减少（ P<0.05）。析因分析结果显示，CBNPs和Cd单独暴露对P62、LC3和IL6的表达发挥明显作用（ P<0.05），但两化学物之间交互作用无统计学意义（ P>0.05）。 结论:CBNPs-Cd复合暴露可能通过激活PERK-eIf2α-ATF4通路，致人支气管上皮细胞自噬受阻、炎症反应增加。

[目的]探究大麻二酚(cannabidiol,CBD)对子宫内膜癌细胞生物学行为具体作用及可能机制.[方法]将Ishikawa和KLE细胞分为对照组、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)组、CBD+DMSO组及CBD+DMSO+GSK2606414(蛋白激酶R样内质网激酶抑制剂)组,通过CCK-8实验、细胞划痕愈合实验、Transwell实验、流式细胞术等实验检测CBD对子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响,通过活性氧(reactive oxygen species,ROS)探针检测细胞内ROS的水平,并通过蛋白质印迹分析(Western blot)检测子宫内膜癌细胞中 C/EBP 同源蛋白(CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)蛋白、PERK-真核翻译起始因子 2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,eIF2α)、转录活化因子4(activating transcription factor 4,ATF4)信号通路相关蛋白的表达,并使用PERK信号通路抑制剂GSK2606414对通路进行验证.[结果]CBD呈浓度及时间依赖性抑制Ishikawa和KLE细胞的增殖能力,CBD在浓度为2～16 μmol/L时显著性抑制Ishikawa细胞的增殖能力(P＜0.05),CBD在浓度为6～16 pmol/L时显著性抑制KLE细胞的增殖能力(P＜0.05).在CBD干预Ishikawa和KLE细胞≥24 h后显著性抑制Ishikawa及KLE细胞的增殖能力(P均＜0.05).CBD抑制Ishikawa和KLE细胞的细胞迁移能力、侵袭能力及诱导细胞凋亡(P均＜0.05).Ishikawa细胞CBD+DMSO组24 h愈合率(37.54％±0.97％),48 h 愈合率(47.87％±1.46％);CBD+DMSO 组 24 h KLE 细胞愈合率(41.93％±2.85％),48 h 愈合率(51.29％±0.75％).CBD 提高细胞内 ROS 水平(Ishikawa P=0.007 4,KLE P＜0.001).CBD 作用于Ishikawa和KLE细胞后,CHOP、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(phosphorylated protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase,p-PERK)、磷酸化真核翻译起始 因 子 2α(phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 2α,p-eIF2α)、ATF4 表达量较对照组及 DMSO 组明显增加(P＜0.001).Ishikawa 和 KLE 细胞在加入 GSK2606414 后 p-PERK(P均＜0.001)、p-eIF2α(P＜0.001)、ATF4(P＜0.001)表达量较CBD+DMSO组下调,但仍高于对照组及DMSO组.[结论]在子宫内膜癌细胞中,CBD通过激活PERK-eIF2α-ATF4信号通路抑制细胞增殖、迁移、侵袭能力,诱导细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用,其抗肿瘤作用可能与内质网应激的激活及ROS积累有关.

目的 探讨利拉鲁肽通过蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)/真核翻译起始因子 eIF2 的 α 亚基(phosphorylation of eukaryotic initiation factor-2α,eIF2α)/活化转录因子 4(activated transcription factor 4,ATF4)/C/EBP 同源蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)通路介导的内质网应激对糖尿病大鼠肾组织损伤的改善作用及其机制.方法 通过高糖高脂饮食和腹腔注射低剂量链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(30 mg/kg)诱导2型糖尿病大鼠模型.STZ注射后5周,糖尿病大鼠随机接受皮下注射或不皮下注射利拉鲁肽(0.2 mg/kg,1次/12 h)治疗8周.将大鼠分为:NC组、DN组和DN+Lira组.测定糖尿病相关物理生化指标、肾脏组织病理学和超微结构变化.相应试剂盒分别检测超氧化物歧化酶(superoxide diamutase,SOD)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)水平.蛋白质免疫印迹分析内质网应激相关蛋白和PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路相关蛋白的表达.结果 STZ注射后5周后DN组的尾静脉空腹血糖(fasting blood glucos,FBG)始终高于NC组;STZ注射后13周(利拉鲁肽给药后8周),DN组和DN+Lira组FBG、血液糖化血红蛋白A1 c(hemoglobin A1c,HbA1c)、肾体重指数、血清肌酐(erum creatinine,SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)显著高于NC组,体重显著低于NC组;DN+Lila组FBG、HbA1c、肾体重指数、SCr和BUN显著低于DN组(P＜0.05).STZ注射后5周(利拉鲁肽给药后0周)时,DN组和DN+Lira组的尿白蛋白/尿肌酐比率显著高于NC组,差异有统计学意义(P＜0.05).研究结束(利拉鲁肽给药后8周)时,DN组和DN+Lira组的尿白蛋白/尿肌酐比率显著高于NC组,DN+Lila组的尿白蛋白/尿肌酐(urinary albumin/creatinine,ACR)显著低于DN组(P＜0.05).DN组和DN+Lira组系膜基质指数显著高于NC组,DN+Lira组系膜基质指数显著低于DN组,差异有统计学意义(P＜0.05).DN组葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein,GRP78)、磷酸化的肌醇需要酶 1α(phosphorylated inositol-requiring enzyme 1α,p-IRE1α),激活转录因子 6(activating transcription factor 6,ATF6)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 12(caspase 12,Caspase-12)的蛋白水平显著高于NC组,DN+Lira组GRP78、p-IRE1α,ATF6和Caspase-12的蛋白水平显著低于DN组(P＜0.05).DN组的MDA、ROS、MPO水平显著高于NC组,SOD水平低于NC组,DN+Lira组中MDA、ROS、MPO水平显著低于DN组,SOD水平高于DN组(P＜0.05).DN组肾皮质中p-PERK、p-eIF2α、ATF4和CHOP水平显著高于NC组,DN+Lira组的肾皮质中p-PERK、p-eIF2α、p-ATF4和CHOP的水平显著低于DN组(P＜0.05).结论 利拉鲁肽可能通过抑制内质网应激介导的PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路而发挥肾脏保护作用.

目的 研究欧前胡素对氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)诱导大鼠离体脑片损伤后内质网应激和PERK/eIF2α/CHOP通路相关蛋白表达的影响.方法 采用OGD/R诱导离体大鼠脑片损伤模型,用MTT法检测脑片的活力,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测脑片的损伤程度,Nissl染色检测神经元的损伤情况,TUNEL检测细胞凋亡.Western印迹检测大脑皮质和海马组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)、磷酸化PERK(p-PERK)、真核翻译起始因子2α(eIF2α)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)、转录激活因子4(ATF4)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和Bcl-2及Bax的蛋白表达.结果 与OGD/R模型组比较,欧前胡素可提高大脑皮质和海马脑片的活力,减轻神经元损伤和降低细胞凋亡率.欧前胡素可下调GRP78,PERK,p-PERK,eIF2α,p-eIF2α,ATF4和CHOP的蛋白表达,降低p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α的比值.此外,欧前胡素还能促进Bcl-2表达,下调Bax表达,升高Bcl-2/Bax比值.结论 欧前胡素可通过减轻内质网应激反应,抑制PERK/eIF2α信号通路激活,抑制神经细胞凋亡,从而减轻OGD/R诱导的大鼠离体脑片损伤.

蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)是内质网上的一种应激感受器,具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性,它既能激活细胞存活信号传导途径,也能促进细胞凋亡.在内质网应激(ERS)的早期阶段激活PERK结构域,导致真核细胞翻译起始因子2α(eIF2β)磷酸化,减少转录启动和蛋白折叠,维持内质网内环境稳态.晚期磷酸化eIF2α则通过转录激活因子4(ATF4)导致促凋亡蛋白C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶12(caspase-12)的过度表达,导致细胞凋亡.PERK通路作为ERS主要信号通路之一,在心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的发生、发展中扮演着重要角色,了解其在MIRI中的作用,可能为改善缺血性心脏病治疗效果提供新的思路.

目的 探讨芪蛭三七汤对心肌梗死(MI)大鼠心室重构及心肌细胞内质网应激凋亡的影响.方法 采用冠状动脉结扎法复制大鼠心肌梗死模型,分为空白对照组(n=15)、假手术组(n=14)、MI组(n=11)及芪蛭三七汤干预模型组(QZ组)(n=13).空白对照组、假手术组和MI组大鼠均灌胃给予无菌生理盐水,QZ组大鼠灌胃给予22.68 g/kg芪蛭三七汤溶液,连续给药4周.采用超声心动图评价大鼠心功能,Western blotting检测大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白以及蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-真核细胞翻译起始因子2α(eIF2α)通路相关蛋白的表达.结果 ①心功能比较:与空白对照组和假手术组大鼠比较,MI组大鼠左室射血分数(LVEF)和短轴缩短率(FS)降低,而左室舒张末径(LVEDd)、左室收缩末径(LVESd)增加(P<0.05).QZ组大鼠LVEF和FS高于MI组大鼠,LVEDd和LVESd低于MI组大鼠(P<0.05).与空白对照组和假手术组大鼠比较,MI组大鼠左室压上升最大速率(+dp/dtmax)和左室压下降最大速率(-dp/dtmax)绝对值降低(P<0.05).QZ组大鼠+dp/dtmax和-dp/dtmax绝对值高于MI组大鼠(P<0.05).空白对照组和假手术组大鼠无梗死区域.QZ组大鼠梗死范围低于MI组大鼠(P<0.05).②心肌细胞凋亡指标:MI组大鼠非梗死区心肌凋亡指数(AI)高于空白对照组和假手术组大鼠(P<0.05).QZ组大鼠非梗死区心肌AI低于MI组大鼠(P<0.05).与空白对照组和假手术组比较,MI组大鼠心肌组织促凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达量升高,而抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)表达量降低(P<0.05).与MI组大鼠比较,QZ组大鼠心肌组织Caspase-3、Bax蛋白表达量降低,Bcl-2蛋白表达量升高(P<0.05).③PERK-eIF2α 信号通路:与空白对照组和假手术组比较,MI组大鼠心肌组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、p-PERK、p-eIF2α 及活化转录因子4(ATF4)蛋白表达量升高(P<0.05).而与MI组大鼠比较,QZ组大鼠心肌组织GRP78、p-PERK、p-eIF2α 及ATF4蛋白表达量降低(P<0.05).结论 芪蛭三七汤可减轻大鼠心肌梗死后心室重构,其机制可能与抑制PERK-eIF2α 信号通路的激活诱导的内质网应激凋亡有关.

目的:观察4-苯基丁酸(4-PBA)对创伤后应激障碍(PTSD)大鼠海马神经元内质网应激(ERS)与凋亡的影响,探讨4-PBA改善PTSD大鼠认知能力的机制.方法:36只成年SD大鼠随机分为正常组、PTSD组和4-PBA+ PTSD组,每组12只.PTSD组采用单次延长应激(SPS)构建PTSD大鼠模型,4-PBA+ PTSD组从造模次日开始每天于固定时间腹腔注射4-PBA(40 mg/kg),连续给药7d.Morris水迷宫实验检测各组大鼠的学习记忆能力;Western Blot实验检测各组大鼠海马葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-真核翻译起始因子2α(eIF2α)-活化转录因子4(ATF4)信号通路相关蛋白表达的变化.结果:在Moms水迷宫实验中,与对照组比较,PTSD组大鼠学习记忆能力明显减退(P＜0.01);与PTSD组比较,4-PBA+ PTSD组大鼠学习记忆功能明显改善(P＜0.01).Western Blot实验结果显示,与对照组比较,PTSD组大鼠GRP78、CHOP的表达明显增加(P＜0.01),Bcl-2的表达显著性减少(P＜0.01),PERK、eIF2α、p-eIF2α表达显著性增加(P＜0.05),与PTSD组比较,4-PBA+ PTSD组大鼠GRP78、CHOP的表达明显减少(P＜0.01),Bcl-2的表达显著性增加(P＜0.05),PERK、eIF2α、p-eIF2α表达显著性减少(P＜0.05).结论:4-PBA能够通过激活PERK-eIF2α-ATF4信号通路抑制PTSD大鼠海马神经元的ERS和凋亡,进而改善PTSD大鼠的认知能力.

该研究旨在探讨鬼针草水煎液对高脂高糖诱导的小鼠非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的作用及相关作用机制.Balb/c小鼠随机分为正常组、模型组、二甲双胍(200 mg·kg-1)组、鬼针草水煎液(10 g·kg-1)组和二甲双胍(100 mg·kg-1)+鬼针草水煎液(5 g·kg-1)联合组.除正常组外,其他4组给予高脂高糖饲料8周,建立非酒精性脂肪肝模型,随后治疗4周,眼球取血,处死取材,检测相关指标.结果 显示,与模型组相比,各给药组血脂血糖水平均明显降低(P＜0.05);HE染色结果表明各给药组的肝组织病理损伤显著改善;油红0染色结果显示各给药组脂肪分布显著减少(P＜0.01);免疫组织化学染色结果显示各给药组的肝组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)蛋白表达量明显降低(P＜0.01);Western blot结果显示给药组内质网应激信号通路相关因子GRP78、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(p-PERK)、真核翻译起始因子2α(eIF2α)、上调激活转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(Chop)、肌醇需求因子1α(IRE1α)和剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸氨基转移酶(cleaved-caspase-12)的蛋白表达水平明显降低(P＜0.01);联合组结果优于单独给药组.该研究表明鬼针草水煎液对高脂高糖所致小鼠非酒精性脂肪肝具有显著的治疗作用,其机制可能与下调内质网应激相关因子的表达,减轻内质网应激所致肝细胞凋亡,下调血脂血糖水平有关.

该研究旨在探讨鬼针草乙酸乙酯提取物对内质网应激所致的肝细胞损伤的保护作用及机制.衣霉素诱导L02细胞建立内质网应激损伤模型;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测鬼针草乙酸乙酯提取物对内质网应激所致L02细胞损伤的存活率;Western blot法检测内质网应激信号通路蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、真核生物翻译起始因子2α(elF2α)、转录因子激活蛋白4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、B细胞淋巴瘤/白血病基因2(Bcl-2)、Bcl-2结合抗凋亡基因(Bax)的表达水平,同时检测加入内质网应激抑制剂(4-苯基丁酸)和shRNA沉默CHOP因子后上述表达情况;免疫荧光法检测L02细胞中GRP78、PERK、CHOP的表达水平.结果 显示,鬼针草乙酸乙酯提取物显著提高内质网应激所致L02细胞损伤的存活率(P＜0.05或P＜0.01),并在一定范围内呈时间剂量依赖性.给药组的GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、Bax表达水平显著降低(P＜O.05或P＜0.O1),Bcl-2表达水平显著升高(P＜0.01);加入内质网应激抑制剂和shR-NA沉默CHOP因子后,GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、Bax表达水平显著降低(P＜0.0l),Bcl-2表达水平显著升高(P＜0.01).免疫荧光结果显示GRP78、PERK、CHOP表达情况与Western blot法检测结果一致.综上,鬼针草乙酸乙酯提取物对内质网应激所致的L02细胞损伤具有显著保护作用,其机制可能与抑制内质网应激,下调PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路所介导的细胞凋亡有关.

目的:探讨内质网应激(ERS)及内质网自噬对移植黑色素瘤模型淀粉样蛋白前体蛋白(APP)/早老素1(PS1)小鼠移植瘤生长的抑制作用,并阐明蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-真核翻译起始因子2α(eIF2α)-活化转录因子4(ATF4)通路在其抑制作用中的可能机制.方法:体外培养B16细胞,通过皮下注射分别植入C57和APP/PS1小鼠背部皮下,建立C57BL/6J和APP/PS1雄性小鼠移植黑色素瘤模型,作为C57移植瘤组(n=7)和APP/PS1移植瘤组(n=7).观察2组小鼠出瘤时间并计算肿瘤体积,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组小鼠移植瘤组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、PERK和溶酶体组织蛋白酶L(cathepsin L)mRNA表达水平,Western blotting法检测2组小鼠移植瘤组织中GRP78、PERK、磷酸化PERK(p-PERK)、真核翻译起始因子2α(eIF2α)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)、活化转录因子4(ATF4)和内质网自噬标志蛋白FAM134B蛋白表达水平,免疫组织化学法检测移植瘤组织中蛋白质二硫异构酶(PDI)蛋白表达情况,免疫荧光法测定2组小鼠移植瘤组织中腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)水平.结果:与C57移植瘤组比较,APP/PS1移植瘤组小鼠出瘤时间晚,肿瘤体积小(P<0.05),移植瘤组织中ERS相关基因GRP78和PERK mRNA表达水平升高(P<0.05),移植瘤组织中GRP78、p-eIF2α/eIF2α和ATF4蛋白表达水平及p-PERK/PERK比值均升高(P<0.05).C57移植瘤组肿瘤细胞胞质内多见黑色素颗粒,为移植瘤组织的形态特征,可见少量棕黄色颗粒,为PDI阳性颗粒;APP/PS1移植瘤组肿瘤细胞胞质内可见少量黑色素颗粒和广泛表达的棕黄色颗粒.与C57移植瘤组比较,APP/PS1移植瘤组小鼠移植瘤组织中内质网自噬标志蛋白FAM 134B蛋白表达水平升高(P<0.05),cathepsin L mRNA表达水平升高(P<0.05),ATP水平降低(P<0.05).结论:APP/PS1移植瘤模型小鼠肿瘤生长缓慢,其机制可能与ERS的PERK-eIF2α-ATF4信号通路被激活有关.