目的:揭示H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)血凝素(hemagglutinin, HA)基因氨基酸位点的变异情况并探讨其分子进化趋势。方法:收集并比对EpiFlu数据库中2020年4月以前H9N2 AIV毒株HA基因序列信息，采用生物信息学的方法分析HA蛋白关键受体结合位点、裂解位点、糖基化位点的氨基酸差异。结果:84.92%(4 067/4 809)序列HA226位点的谷氨酰胺(glutamine, Q)被亮氨酸(leucine, L)替代；来自禽类的序列发生HA-Q226 L突变的占84.75%(4 013/4 735)，来自哺乳动物的序列发生HA-Q226 L突变的占72.97%(54/74)；96.26%(4 629/4 809)序列HA蛋白裂解位点基序模式仍保持低致病性AIV的特点，但有180条来自禽类的序列HA蛋白裂解位点插入了2个碱性氨基酸；58.68%(2 822/4 809)序列新增1个或者2个潜在糖基化位点，而66.44%序列(3 195/4 809)丢失糖基化位点HA210-212。结论:H9N2亚型AIV HA蛋白受体结合位点趋于结合人类受体，对哺乳动物的适应性增加，HA蛋白裂解位点和糖基化位点有向高致病性AIV的序列特征突变的倾向。

目的:研究2022—2024年盐城市分离的甲型H3N2流感病毒血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(neuraminidase, NA)分子进化特征。方法:收集盐城市2022年4月至2024年3月间的流感哨点监测医院以及各县市区流感暴发点采集的流感样病例标本，Rt-qPCR进行核酸检测，阳性样本进行病毒分离。分离的甲型H3N2毒株，采用一步RT-PCR方法扩增HA1和NA基因并测序，采用相关生物信息学软件分析基因核苷酸、氨基酸位点变异及进化特征。结果:2022年4月至2024年3月间共采集5 020份样本，流感病毒核酸阳性检出率为18.59%(933/5 020)。2022年4月至2024年3月两个监测季冬春季流感峰明显，其中，仅2022年4月—2023年3月监测季夏季流感峰明显，甲型H3N2亚型流感病毒是两个监测季的优势流行株。遗传进化树显示：2022—2024年盐城市32株甲型H3N2毒株HA1和NA基因在各分支的聚类关系基本一致，2023—2024年24株分离株的HA1基因和NA基因与2022—2024年北半球疫苗株A/Darwin/9/2021(H3N2)聚类位于3C.2a1b.2a.2a.3a.1进化谱系；2022年8株分离株与2021—2022年北半球疫苗株A/Cambodia/e0826360/2020(H3N2)聚类位于3C.2a1b.2a.1a进化谱系。6株分离株(A/JSTH/11735/2023、A/JSTH/11788/2023、A/JSTH/11974/2023、A/JSYD/353/2023、A/JSYD/354/2023、A/JSTH/138/2023)均发生F79L、N122D、P239S、K276E氨基酸位点的变异，既存在于散发株又存在于暴发株。盐城市甲型H3N2毒株HA1基因编码区抗原表位、受体结合位点、糖基化位点发生了一定程度变异，基因层面上分析，2023—2024年24株分离株与2022—2024年北半球疫苗株A/Darwin/9/2021免疫原性匹配性较好，2022年8株分离株与2021—2022年北半球疫苗株A/Cambodia/e0826360/2020免疫原性匹配性较好。盐城市分离株未发生NA蛋白酶活性位点以及耐药位点的变化。结论:2022—2024年盐城市流行的甲型H3N2毒株HA1和NA基因正逐渐发生抗原性漂移，增加推荐疫苗株的不匹配度，造成流感的暴发流行。2022年盐城市分离株相对于疫苗株A/Darwin/9/2021(H3N2)已发生实质性抗原漂移。需要对甲型H3N2流感病毒进行动态监测及时发现变异株。

目的:在原核系统中表达流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)头部蛋白并进行血清学分析。方法:将H1N1和H3N2型流感病毒的HA头部蛋白编码基因克隆到pET-22b(+)原核表达质粒中，通过IPTG诱导，在大肠埃希菌BL21中获得含有HA头部与His-Tag的融合蛋白rH1N1-HA和rH3N2-HA。SDS-PAGE分析IPTG诱导前后的融合蛋白，验证表达的准确性，Western blot验证重组蛋白的表达。纯化重组蛋白，多剂次免疫家兔，获得针对H1N1-HA和H3N2-HA头部的多克隆抗体。同时，重组蛋白免疫BALB/c小鼠，评价其免疫原性。结果:rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白在小鼠体内诱导了滴度高于40的血凝抑制抗体，可作为一种保护性抗原。rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白制备的多克隆抗体，可作为Western blot、ELISA等免疫学应用的重要材料。结论:本研究制备的HA头部蛋白可作为一种保护性抗原，在小鼠体内诱导保护性抗体。HA头部制备的多克隆抗体，可用于甲型流感病毒的免疫学和血清学研究。

目的:对活禽市场环境中检出的3份H5N6亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）标本进行测序鉴定和基因特征分析，为预防人感染H5N6亚型AIV提供依据。方法:通过实时荧光定量PCR确定病毒型别，采用二代测序方法对病毒血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）基因序列进行测序。使用NCBI中BLAST模块进行比对，用Mega7.0软件构建进化树并进行基因特征分析。结果:3份H5亚型阳性标本经测序鉴定为H5N6亚型AIV，属于Clade2.3.4.4支系。病毒的HA蛋白存在6个连续碱性氨基酸（LRERRRKRGL，其中R，K为碱性氨基酸）；病毒HA蛋白的受体结合位点238~240位氨基酸是QRG（氨基酸排序以H3-HA为准），受体特征为禽源；NA蛋白第69~73位点氨基酸未出现茎缺失。结论:环境中3份H5亚型AIV核酸阳性病毒鉴定为新型H5N6亚型AIV，属于高致病AIV，但具有不容易感染人的受体结合特征。活禽市场中持续存在H5N6病毒，对人类健康和公共卫生存在威胁，需要继续加强监测。

目的:分析上海市松江区2017—2020年乙型流感病毒流行情况及其血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)基因特征。方法:使用实时荧光逆转录-聚合酶链式反应检测流感病毒疑似病例的标本，乙型流感病毒阳性标本接种犬肾细胞和鸡胚培养病毒。对乙型流感毒株HA和NA基因测序，序列进行基因进化及氨基酸变异分析，采用神经氨酸酶抑制实验研究毒株对奥司他韦和扎那米韦的敏感性。结果:2017—2020年度松江区乙型流感病毒阳性率为14.24%(506/3 554)，主要流行季为冬春季，呈现B/Victoria和B/Yamagata亚型交替流行的特点。松江B/Victoria流行株主要位于1A(△3)B进化分支，少数位于1A及1A(△2)分支，与疫苗株B/Brisbane/60/2008相比，流行株HA和NA核苷酸同源性分别在97.62%~98.19%、98.11%~98.78%，1A(△3)B分支HA蛋白抗原决定簇区突变主要发生在120环和160环。B/Yamagata流行株均位于3进化分支，与疫苗株B/Phuket/3073/2013相比，HA(NA)核苷酸同源性98.71%~99.04%(98.69%~99.27%)，未发现抗原决定簇区氨基酸改变。神经氨酸酶抑制实验显示，所测的乙型流感病毒对奥司他韦和扎那米韦均敏感。结论:2017—2020年乙型流感病毒流行株与疫苗株抗原性匹配度不佳，需持续做好乙型流感病毒监测及病原学特征分析，为流感疫苗筛选及药物研发提供科学依据。

目的:了解苏州市2021年7月至2022年1月流感流行期间乙型流感病毒(influenza B virus, FluB)的基因组和遗传进化特征。方法:采用实时荧光－逆转录聚合酶链反应(Real-time fluorescence reverse transcription polymerase chain reaction, Real-time RT-PCR)法对标本进行流感病毒(influenza virus, Flu)分型检测。对检出的FluB毒株，经全基因组捕获和文库构建，利用Miseq高通量测序平台对样本进行测序。采用MEGA X软件以邻接法(Neighbor-Joining method, NJ)构建FluB血凝素(hemagglutinin, HA)、神经氨酸酶(neuraminidase, NA)和基质蛋白(matrix protein，MP)基因系统发育树；采用NetNGlyc 1.0 server软件预测HA和NA蛋白潜在N-糖基化位点。结果:在送检的1 500份咽拭子样本中，280份检出FluB，对其中53株样本完成了FluB全基因组序列测定。序列分析显示，FluB毒株8个基因节段(PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、MP、NS)核苷酸序列相似性分别为99.3%~100%、98.1%~100%、98.8%~100%、98.0%~100%、99.2%~100%、98.4%~100%、98.2%~100%、99.0%~100%。除2021年7月4份样本的FluB为V1A.3进化分支外，其余样本均为V1A.3a.2进化分支。与疫苗株B/Washington/02/2019相比，2021年10月份以后样本的FluB HA蛋白氨基酸序列存在9~11个差异位点，共享9个突变位点(H122Q、A127T、R133G、P144L、N150K、G184E、N197D、K203R、R279K)；未发现奥司他韦等NA抑制剂相关耐药突变。FluB HA和NA蛋白分别具有11个和4个潜在糖基化位点。结论:2021年7月至2022年1月期间，苏州市流行的FluB以V1A.3a.2毒株为优势流行株，HA和NA蛋白氨基酸序列发生多位点突变。

探讨山东省青岛市地区急性呼吸道感染患儿人副流感病毒3型（HPIV-3）的感染情况，并分析HPIV-3血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）基因特征。本研究为横断面研究，青岛市妇女儿童医院、青岛大学附属医院西海岸院区及崂山院区在2018年1月至2019 年12月期间，每月随机采集急性呼吸道感染（ARTI）儿科患者的咽拭子样本，总共1 674份，采用多重实时荧光逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法，筛查HPIV-3阳性样本。采用巢式PCR方法扩增HPIV-3阳性样本HN全长基因并进行序列测定，序列结果与GenBank中HPIV-3的代表株进行对比分析，建立系统进化树。结果显示，1 674份咽拭子样本中，HPIV-3阳性有90份，检出率为5.37%，其中，6岁以下儿童占97.78%（88份）。HPIV-3阳性病例主要分布在春季和夏季。通过巢式PCR方法扩增得到44株HPIV-3 HN基因全长序列，序列比对及进化分析表明，HPIV-3 HN基因属于C3基因亚型的C3a和C3b分支，其中，C3a亚型有30株，C3b亚型有14株。44株青岛分离株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.0%~100.0%和98.5%~100.0%。综上，2018至2019年间，HPIV-3 C3基因型的C3a和C3b分支在山东省青岛市地区循环流行，其HN基因型变异较小，进化上具有一定的地域特征。

目的:制备重组流感病毒血凝素(hemagglutinin, HA)三聚体蛋白疫苗并进行相关表征分析，研究重组HA三聚体在小鼠模型中的免疫原性。方法:构建稳定表达HA三聚体蛋白的CHO细胞株，通过Western blot、单向免疫扩散试验、蛋白质粒径检测和N-糖基化位点分析对重组蛋白进行定性及定量分析。根据剂量、佐剂等处理条件的不同将BALB/c小鼠分为11个组，并进行一致的免疫程序。初次免疫后56 d检测血清中和抗体效价，以评价免疫原性。结果:构建的CHO细胞株能够分泌表达HA三聚体。HA三聚体具备生物学活性能够在单向琼脂免疫扩散试验中形成沉淀环，蛋白质粒径大小约为18.79 nm，具有10个N-糖基化位点，包括高甘露糖型、复合糖型和杂合糖型；HA三聚体重组蛋白疫苗在2次免疫小鼠后，3.75 μg剂量配伍RFH01佐剂与对照组单价疫苗原液15 μg引起的中和抗体效价差异无统计学意义( P＝0.431 2， U＝36)，配伍佐剂组免疫后血清抗体效价均高于未加佐剂组，其中15 μg HA三聚体+RFH01组效价最高，为1 280。 结论:成功制备了流感病毒重组HA三聚体蛋白，其与RFH01佐剂配伍能够诱导BALB/c小鼠产生针对流感病毒的体液免疫应答，为流感病毒重组亚单位疫苗的研发提供了参考。

目的:分析活禽市场相关环境中检出的H7N9禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)的遗传进化和分子特征。方法:采集禽类粪便、污水，以及脱毛机和案板擦拭拭子等标本，实时荧光定量PCR鉴定甲型流感病毒和H7N9亚型。对于H7N9阳性标本以甲型流感病毒通用引物扩增病毒全基因组并测序，利用BLAST和MEGA X软件进行序列比对、系统进化和分子特征分析。结果:2023年2月采集于许昌市活禽市场的7份外环境标本中检出4份H7N9 AIV阳性，3份H7N9 AIV阳性标本测序成功，其各基因核苷酸一致性较高(98.37%～100.00%)。BLAST分析显示主要与我国2020—2021年国内禽中分离的H7N9毒株一致性最高。遗传进化分析显示3株病毒株聚在同一分支，与最近环境分离株相聚较近，而与最近人/禽感染病毒株关系较远。通过与各时期的代表性病毒株序列比对发现，本研究检出的病毒株呈禽高致病性，裂解位点处插入了4个氨基酸KRAA，病毒株血凝素受体结合位点为QSG，属于禽结合受体，血凝素出现G186I位点突变。聚合酶碱性蛋白2未出现哺乳动物适应性E627K突变。未检测到与神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦)和聚合酶酸性蛋白抑制剂(巴洛沙韦)耐药相关的R292K和I38T位点突变，提示病毒对上述药物敏感性未降低。M2蛋白出现S31N突变，提示对烷胺类药物耐药。结论:从活禽市场检出的3株H7N9病毒株呈禽高致病性，与既往感染人/禽代表株相比，未明显增加人受体结合力、哺乳动物致病性、病毒传播力和耐药相关分子位点。

目的:以痘苗病毒中和抗体表位D8L区为重组位点进行外源基因替换，从而降低载体自身免疫原性。方法:通过同源重组技术，插入表达流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)序列，对D8L区进行替换，构建重组痘苗病毒流感疫苗，同时以表达相同HA的TK区重组痘苗病毒疫苗为对照。Western blot对HA的表达进行验证；小鼠实验、ELISA、血凝抑制试验检测每次免疫后2周的血清抗体效价，攻毒保护试验评价重组痘苗病毒的保护效力。结果:Western blot表明构建的重组疫苗均能正确表达HA D8L蛋白。ELISA、血凝抑制试验显示，初次免疫后，D8L区突变的重组痘苗病毒疫苗HA抗体效价略高于TK区突变的重组疫苗，并随着免疫次数的增多差异有统计学意义( P<0.05)；其免疫原性显著低于TK区突变的重组疫苗( P<0.05)，随着免疫次数增加，二者差异无统计学意义( P>0.05)。H1N1pdm攻毒后保护效力评价结果显示，D8L区突变组可完全清除病毒，且小鼠肺部炎症水平更低、组织损伤更少。 结论:通过将外源基因插入到痘苗病毒载体中和抗体表位D8L区，有助于降低载体自身的免疫原性，并提高外源基因的免疫原性，为痘苗病毒载体在疫苗或基因治疗领域作为递送工具提供了参考。