目的:应用腺相关病毒(AAV)-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统体外实验研究基因治疗威尔森氏症(WD)。方法:选用2月龄雄性Toxic milk (TX)小鼠作WD模型，设计小向导RNA(sgRNA)并构建含有CRISPR元件的AAV载体质粒命名为pAAV-sgRNA1、2、3，制备AAV，病毒滴度达1～4×10 13 GC/ml；感染WD肝细胞，72 h后提取基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率，筛选出其中活性最高者sgRNA1，构建相应的同源修复模板(HT)质粒命名为pAAV-HT，应用AAV-sgRNA1和AAV-HT共感染WD肝细胞，测序和T7E1酶切检测模板修复效率；用HT特异性引物行PCR，验证HT掺入。组间比较采用Student’s t检验。 结果:Sanger测序结果显示，sgRNA1在体外有最高的编辑效率[(20.2±2.3)%]，与sgRNA2、3比较[(3.1±1.3)%、(14.6±2.0)%]，差异有统计学意义( P<0.05)。进一步用HT进行基因修正，能检出特异性修正后的ATP7B基因；二代测序测序显示修复率为(7.9±2.7)%。 结论:AAV-CRISPR系统在体外可以达到较高编辑效率和修复效率。

目的:探讨青藏高原鼠疫自然疫源地鼠疫菌规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）的基因型及其地区分布。方法:选取青海省地方病预防控制所保存的1954-2011年在不同地区宿主、媒介体内分离的1 004株鼠疫菌作为实验对象，采用传统的苯酚-氯仿混合抽提法提取鼠疫菌DNA。分别对3个CRISPR位点（YPa、YPb和YPc）进行PCR扩增、测序，将所测得CRISPR序列与文献最新报道的CRISPRDictionary数据库进行检索比对，以鉴定间区序列（spacer）；对CRISPR各位点新发现的spacer，在美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库进行Blast序列比对，推测基因序列来源。根据CRISPR spacer阵列的多态性对青藏高原鼠疫菌进行基因分型。结果:1 004株鼠疫菌共发现53种spacer，其中新发现6种，分别为a105、a106、a107、b51、b52、c14；1 004株鼠疫菌被分成44个不同的CRISPR基因型，10大类群，新发现基因型15种，喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地鼠疫菌CRISPR基因型以G26-a1′、G7、G22、G24-a1′、G22-a1′、G9、G26-a1′a60型为主，青海田鼠鼠疫自然疫源地鼠疫菌CRISPR基因型为G37-a6′型。结论:青藏高原鼠疫自然疫源地鼠疫菌CRISPR基因型具有高度多样性，且地区分布特征显著。

鉴于目前核酸分子检测技术逐步从临床实验室向现场检测转移的发展趋势，急需建立一种高灵敏、高特异、高效和便捷的新型核酸诊断工具来满足临床即时检测（POCT）的需要。基于规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）的检测方法是一种有前景的新型核酸检测方法。该方法中Cas效应蛋白能够识别高度特异的核酸序列，通过联合高灵敏小型生物传感器运用于POCT，在满足高灵敏性和高特异性的同时具备了检测的高效、便捷的特点。本文综述了近几年基于CRISPR/Cas技术集成小型现场分析传感器相关领域的进展，并讨论了POCT相关检测的研究前景及挑战。

目的:观察叉头框K1(FOXK1)-卷曲螺旋结构域蛋白43(CDC43)轴对大肠癌细胞迁移和上皮-间充质转化(EMT)的影响。方法:选取2017年9月到2019年9月南阳医学高等专科学校第一附属医院收治的103例大肠癌和对应的癌旁组织作为研究对象，采用免疫组织化学分析FOXK1蛋白表达水平；采用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR-Cas9)技术在SW480细胞中建立FOXK1敲除细胞系(FOXK1 KO组)和对照细胞系(对照组)，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测两组细胞增殖；采用Tanswell分析两组细胞迁移；采用蛋白质印迹法(Western blot)检测两组细胞EMT。组间比较采用 t检验。 结果:与癌旁组织FOCK1表达水平(40.32±6.90)比较，大肠癌组织FOXK1蛋白表达水平显著增高(159.21±13.85)，差异有统计学意义( t＝4.918， P<0.05)。与对照组细胞FOXK1蛋白表达水平(1.09±0.21)比较，FOXK1 KO组细胞FOXK1蛋白表达水平显著下降，差异有统计学意义( t＝5.012， P<0.05)。与对照组细胞吸光度值(1.94±0.28)比较，FOXK1 KO组细胞吸光度值显著下调(1.07±0.19)，差异有统计学意义( t＝3.162， P<0.05)。Transwell结果显示，与对照组细胞迁移数量[(95.28±10.20)个]比较，FOXK1 KO组细胞迁移数量显著下降[(48.39±8.21)个]，差异有统计学意义( t＝3.091， P<0.05)。与对照组细胞上皮细胞标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平(0.26±0.08)比较，FOXK1 KO组细胞E-cadherin表达水平显著增高(1.05±0.11)，差异有统计学意义( t＝3.001， P<0.05)。与对照组细胞间质细胞标志物N-钙黏蛋白(N-cadherin)(0.78±0.13)和波形蛋白(Vimentin)(1.15±0.19)表达水平比较，FOXK1 KO组细胞N-cadherin(0.31±0.11)和Vimentin表达水平显著下调(0.39±0.14)，差异有统计学意义( t＝2.891、2.318， P<0.05)。与对照组细胞CCDC43表达水平(1.20±0.22)比较，FOXK1 KO组细胞CCDC43蛋白表达水平显著下调(0.57±0.18)，差异有统计学意义( t＝2.581， P<0.05)。 结论:FOXK1在大肠癌中高表达，通过调控CCDC43蛋白水平调节大肠癌细胞增殖、迁移和EMT。

目的:探讨T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)对肝癌细胞迁移和黏附的影响及其机制。方法:选取2015年6月到2018年6月南阳医学高等专科学校第一附属医院手术切除的104例肝癌组织和癌旁组织作为研究对象，采用蛋白质印迹法(Western blot)和荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析肿瘤组织和癌旁组织中Tiam1蛋白和mRNA表达水平；采用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR-Cas9)技术在肝癌细胞株HepG2和MHCC-97H中建立Tiam1敲除细胞株，分别命名为HepG2 Tiam1 KO组和HepG2对照组；MHCC-97H Tiam1 KO组和MHCC-97H对照组。采用Transwell分析肝癌细胞迁移能力；采用基质黏附实验分析肝癌细胞的黏附能力；采用Western blot分析迁移和黏附相关蛋白的表达水平。组间比较采用 t检验。 结果:与癌旁组织中Tiam1蛋白和mRNA表达水平(1.49±0.21、1.07±0.19)比较，肝癌组织中Tiam1蛋白和mRNA表达水平(3.10±0.37、2.87±0.31)显著增加，差异有统计学意义( t＝3.058、2.891， P<0.05)。与HepG2对照组和MHCC-97H对照组细胞迁移数量[(142.17±20.48)、(169.10±24.19)个]比较，HepG2 Tiam1 KO组和MHCC-97H Tiam1 KO组细胞迁移数量[(76.91±9.87)、(91.55±7.52)个]显著下降，差异有统计学意义( t＝4.128、3.944， P<0.05) 。与HepG2对照组和MHCC-97H对照组细胞黏附能力(142.17±20.48、169.10±24.19)比较，HepG2 Tiam1 KO组和MHCC-97H Tiam1 KO组细胞黏附能力(76.91±9.87、91.55±7.52)显著下降，差异有统计学意义( t＝4.128、3.944， P<0.05)。与HepG2对照组和MHCC-97H对照组细胞黏着斑激酶(FAK)蛋白表达水平(1.09±0.19、1.59±0.24)比较，HepG2 Tiam1 KO组和MHCC-97H Tiam1 KO组细胞FAK蛋白表达水平(0.39±0.11、0.44±0.19)显著下降，差异有统计学意义( t＝3.208、3.011， P<0.05)。 结论:Tiam1通过影响FAK蛋白表达水平，进而调控肝癌细胞的迁移和黏附能力。

规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统存在于大多数细菌与所有的古生菌中，用于抵御外源性遗传物质的入侵，是自我防御的重要手段。CRISPR/Cas技术作为一种简便、快速、灵敏、特异的检测工具，被广泛应用于农业、工业、牧业以及医学等领域。本文主要对CRISPR/Cas系统与荧光、可视化及表面增强拉曼光谱等检测技术相结合的生物传感器的应用现状、优势和局限性以及未来的发展方向进行阐述。

目的:应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法:选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型，设计3个CRISPR来源的RNA (crRNA)-crRNA001/002/003，应用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)方法转染WD肝细胞，48 h后提取基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率，筛选出效率最高者crRNA001，并设计相应的单链寡核苷酸(ssODN)修复模板；用crRNA001和ssODN共转染肝细胞，模板特异性引物行PCR，验证ssODN掺入。组间比较采用Student’S t检验。 结果:Sanger测序结果显示，crRNA001的编辑效率为(57.8±5.1)%。用ssODN共转染细胞后，模板特异性引物行PCR，能扩增出修正后的铜离子转运ATP酶β肽(ATP7B)基因条带；二代测序结果显示，ATP7B基因修复效率为(7.45±2.54)%。结论:CRISPR/Cas9 RNP转染能达到较高编辑效率，相应的ssODN可以高效修复缺陷ATP7B基因，为进一步的体内实验提供理论和实验基础。

神经遗传病是一组主要累及神经系统，包括中枢神经、周围神经、肌肉的遗传性疾病，临床表现复杂多样，治疗难度较大。近年来，随着对神经遗传性疾病病因和发病机制的深入研究，针对突变基因研发的基因治疗方法如反义寡核苷酸、RNA干扰、腺相关病毒介导的基因转导、具有基因修饰作用的小分子化合物和规律间隔成簇短回文重复序列/Cas9基因编辑等以及针对致病机制关键靶点研发的具有潜在疗效的药物逐步向临床应用转化，为神经遗传病患者的治疗带来新的希望。

过去30年来，基因疗法给多种遗传性和获得性视网膜疾病患者带来了很大希望。在大量临床前研究的基础上，全球已进行了60多项视网膜疾病基因疗法的各期临床试验，且Luxturna，一种用于由 RPE65突变导致的2型Leber先天性黑朦(LCA2)的基因治疗产品已批准用于临床。目前的基因传递系统虽然在临床研究中取得了一些成功，但为保证安全性和有效性，仍然需要在载体和眼内给药方式上加以改进和变通。新的腺相关病毒载体技术的发展使大基因传递和小创伤载体注射方式的研究都有所进展。规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)技术也丰富了基因疗法的手段，必将在视网膜疾病的治疗中得到广泛应用。虽然基因疗法仍面临许多挑战，但预计在未来若干年中，它将成为目前许多不可治性视网膜疾病的临床治疗选择。

目的:明确铁载体毒力基因 entB对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）毒力的影响。 方法:从昆明医科大学第一附属医院收集到的30株CRKP菌株中筛选出CRKP-27作为实验菌株，规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）-Cas9基因敲除技术构建 entB基因缺失株Δ entB、回补株C-Δ entB，并通过PCR验证敲除及回补是否成功。观察CRKP-27、Δ entB、C-Δ entB菌株的菌落形态并进行拉丝试验，初步了解 entB对CRKP菌落形态和毒力表型的影响。绘制菌株生长曲线，测定 entB对CRKP菌株生长的影响。铬天青S（CAS）检测液对菌株产铁载体能力进行定量检测。建立小鼠腹腔感染模型，观察小鼠生存率直观了解 entB基因对CRKP毒力的影响。计量资料均采用平均数±标准差表示，服从正态分布的数据采用方差分析进行组间比较，不服从正态分布的数据采用Kruskal-Wallis秩和检验。小鼠生存分析用Log-Rank检验进行比较。 P<0.05表示差异具有统计学意义。 结果:PCR结果显示缺失株和回补株构建成功。 entB基因对CRKP的菌落形态、荚膜和毒力表型无明显影响。Δ entB组的生长速度明显快于CRKP-27组（ P=0.008）和C-Δ entB组（ P=0.001），说明 entB基因削弱了CRKP菌株的生长能力。 entB组与CRKP-27组（ P=0.001）和C-Δ entB组（ P=0.001）相比铁载体产量明显下降，分别下降11.739 3%和11.964 2%，说明 entB基因显著增加了CRKP产铁载体能力。动物实验中，与CRKP-27组（ P=0.023）和C-Δ entB组（ P=0.024）相比，Δ entB组小鼠生存率明显增高，说明 entB基因增加了CRKP菌株的毒力。 结论:铁载体毒力基因 entB明显减弱了菌株的生长能力，但使CRKP产铁载体能力、毒力明显增强。