目的:构建跨膜蛋白(transmembrane protein，TMEM)240慢病毒载体，并在人神经母细胞瘤细胞中表达。方法:提取人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的RNA，逆转录成cDNA并作为模板，聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)扩增TMEM240的CDS序列，与pLVX-EGFP-N1载体连接，转化、验菌送公司测序，pLVX-TMEM240-EGFP-N1质粒与慢病毒包装质粒共转染293Ta细胞，收取上清，感染SH-SY5Y，嘌呤霉素筛选，获得表达TMEM240的SH-SY5Y细胞，将感染pLVX-EGFP-N1的SH-SY5Y细胞作为对照组，感染pLVX-TMEM240-EGFP-N1的SH-SY5Y细胞为实验组。通过共聚焦显微镜、实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative PCR，Real-time PCR)和Western blot检测细胞中TMEM240表达。结果:测序结果显示pLVX-TMEM240-EGFP-N1质粒构建成功；共聚焦显微镜下，表达TMEM240的细胞内出现点状绿色荧光；Real-time PCR及Western blot结果表明细胞内TMEM240表达。结论:成功构建TMEM240慢病毒载体，慢病毒在基因和蛋白水平均引起TMEM240表达升高。

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)在银屑病中作为竞争性内源RNA(ceRNA)调控微小RNA(miRNA)和基因表达的临床与病理意义.方法 下载银屑病患者正常组织、非皮损组织、皮损组织3类60个样本的高通量测序数据(GSE63980),通过生物信息的研究方法构建了银屑病不同类型样本之间差异lncRNA-mRNA共表达网络.通过StarBase数据库下载miRNA、lncRNA和mRNA的靶向关系对,通过计算二者的皮尔森相关系数(r≥0.7,P<0.05)和共享miRNA靶点,构建了银屑病竞争性内源RNA(ceRNA)网络.利用文献证实的银屑病相关的miRNA、lncRNA、mRNA作为种子节点计算随机游走得分,筛选出银屑病相关的lncRNA,并对部分结果开展了GO(gene ontology)功能分析和KEGG通路分析,通过文献检索验证了部分lncRNA具有潜在的ceRNA关系.结果 识别了正常和皮损组织中显著差异的677个mRNA,356个lncRNA;正常和非皮损组织中显著差异的240个mRNA,77个lncRNA;皮损和非皮损组织中显著差异的612个mRNA,209个lncRNA.在共表达网络中的mRNA主要参与的GO通路有G蛋白偶联受体活性、DNA绑定、氮化合物代谢等,KEGG信号通路主要有嗅觉传导、味觉传导等.在ceRNA网络中的mRNA主要参与的GO通路有跨膜受体活性、信号受体活性等,KEGG信号通路主要有系统性红斑狼疮,自身免疫疾等.结论 GAS5与HOTAIR等多个lncRNA在银屑病不同样本中通过与基因竞争miRNA形成潜在的ceRNA关系,有望成为银屑病诊断,治疗的靶标.

[目的]对金黄色葡萄球菌前噬菌体的PT1028ORF001基因进行生物信息学分析,并进行原核表达,为金黄色葡萄球菌前噬菌体基因的功能研究提供参考数据.[方法]将金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌株功能未知的基因通过BLAST比对,从中发现了一个噬菌体PT1028的基因序列,将该基因命名为PT1028ORF001.使用Protparam、ProtComp9.0、NCBI保守结构域数据库、TMpred、NetPhos 3.1 Server、PSIPRED、SWISS-MODEL等在线生物信息软件,分析PT1028ORF001蛋白的理化性质、亚细胞定位、保守结构域、跨膜区域、磷酸化修饰位点、二级结构和三维结构.用自行设计的引物扩增PT1028ORF001基因,扩增产物经酶切回收后与原核表达载体pET-32a相连接,构建重组表达质粒,将该重组质粒转化E.coli TG1内,经菌落PCR鉴定后,增菌培养并提取质粒,再转化E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测分析.[结果]PTI028ORF001蛋白由569个氨基酸组成,相对分子质量为64 671.34 Da,等电点为8.07,负电荷氨基酸残基总数为71个,正电荷氨基酸总数为73个,分子式:C2894H4530N762O885S16,原子总数9087个,是一种稳定的亲水蛋白质,定位于细胞膜上,与功能未知的DUF927蛋白超家族具有高度同源性,第202-223、240-258位氨基酸分别形成一个典型的跨膜区,潜在的磷酸化修饰位点共71个,二级结构中α螺旋占比最高(40.60％),其次是无规则卷曲(39.89％),三维空间结构与二级结构预测结果相符.成功构建了表达载体pET-32a(+)-PT1028ORF001,经IPTG诱导后重组蛋白获得了表达,蛋白相对分子质量为82.4 kDa.[结论]PT10280RF001基因的生物信息学分析结果以及该基因的成功克隆与表达,为深入研究该蛋白及其他金黄色葡萄球菌前噬菌体基因的功能奠定了一定基础.

目的 探讨小肠出血损伤对大鼠肠黏膜内跨细胞白蛋白转运的影响.方法 选取40只SD雄性大鼠,体重240～280 g,随机分为对照组和模型组,每组20只.采用7.5 mg/kg双氯芬酸灌胃,诱导大鼠小肠黏膜损伤模型,建立大鼠非甾体类抗炎药(NSAIDs)肠黏膜损伤模型.将以上两组再随机分为急性期(T1)和亚急性期(T2)亚组,每组10只.对照组以1 ml纯化水灌胃;模型组以7.5 mg/kg双氯芬酸灌胃.T1亚组在灌胃1 d后处死,T2亚组灌胃5 d后处死.根据小肠损伤程度病理评分进行评价.测定大鼠血清中一氧化氮(NO)、白蛋白含量,同时测定荧光标记白蛋白,研究大鼠肠黏膜中白蛋白跨细胞转运的情况.结果 7.5 mg/kg双氯芬酸能引起大鼠小肠黏膜严重的出血性损伤,小肠黏膜可见糜烂、溃疡、红斑,局部肠腔见囊样扩张,且T1、T2模型组小肠的损伤程度均大于T1、T2对照组(P<0.05),T2模型组小肠的损伤程度大于T1模型组(P<0.05).T1模型组血清NO含量显著低于T1对照组(P<0.05),T2模型组NO含量显著高于T1对照组和T1模型组(P<0.05).T1、T2模型组血清白蛋白显著低于T1、T2对照组(P<0.05),T2模型组较T1模型组显著降低(P<0.05).结论 短期小剂量的双氯芬酸能引起大鼠小肠黏膜损伤出血,并随着时间的延长而加重;小肠出血损伤会影响大鼠肠黏膜内跨细胞白蛋白的转运,从而导致NSAIDs性肠黏膜损伤.

大疱性类天疱疮的两个自身抗原存在着不同的分子生物学特性。大疱性类天疱疮抗原220～240kD是人表皮基底细胞内半桥粒斑的成分,含2606氨基酸,空间结构可能是双螺旋。大疱性类天疱疮抗原180kD为跨膜蛋白,由1572氨基酸组成,其中有很多胶原域,推测为一种新的胶原蛋白成分。在大疱性类天疱疮的发病机制中,大疱性类天疱疮抗原180kD可能具有更重要的意义。

目的 纯化白色念株菌(Candida albicans)谷氧还蛋白(glutaredoxin,Grx)并制备多克隆抗体. 方法 从NCBI网站搜索白色念株菌Grx蛋白序列,采用利用生物信息学方法分析其生物学特性.以白色念珠菌DNA为模板,PCR扩增Grx基因,双切后与质粒pET28a相连,连接产物pET28a-Grx转入表达菌BL21 (DE3),使用IPTG诱导目的蛋白表达,使用亲和层析纯化目的蛋白.用Grx蛋白免疫小鼠,制备抗血清,进行Western blot和ELISA检测. 结果 白色念珠菌Grx蛋白含有一个CXXC结构域,属跨膜蛋白.其二级结构中58.8％的氨基酸为α-螺旋,12.6％为β片层,23.5％为无规卷曲,三级结构与酵母Grx蛋白结构相似.Grx蛋白具有多个B细胞表位.获得Grx基因并成功构建重组质粒pET28a-Grx,转染DE3后表达15.2×103的重组蛋白.用纯化的重组Grx蛋白免疫小鼠,获得的多克隆抗体ELISA效价为1∶10 240. 结论 成功表达白色念株菌Grx蛋白并制备了高滴度的多克隆抗体,为Grx的活性研究奠定了实验基础.

spindlin基因是减数分裂纺锤体相关因子,为了研究spindlin基因在二倍体和三倍体雌性虹鳟减数分裂过程中出现的差异,通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得spindlin基因cDNA 4529 bp(GenBank登录号:MN378564),其中3′非编码区(UTR)和5′非编码区(UTR)分别长3662 bp和141 bp,开放阅读框(ORF)长726 bp,编码241个氨基酸,该蛋白质序列的相对分子量为28.3 kD,理论等电点值为5.94,无跨膜结构.同源性分析表明,虹鳟(Oncorhynchus mykiss)与银大马哈鱼(Oncorhynchus kisutch)同源最高,高达99.59％.系统发育进化树显示,虹鳟与大鳞大马哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)和红点鲑(Salvelinus alpinus),聚为一支.实时荧光定量(RT-PCR)结果显示,spindlin基因在二倍体雌性虹鳟卵巢、肾、肝、脾、肌、鳃、心、眼、肠和鳍组织中均有表达,其中,在卵巢中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01).对于二倍体雌性虹鳟,在受精后240—300d(days post fertilization,dpf)发育阶段,spindlin基因在卵巢组织中的相对表达量显著下降.对于三倍体雌性虹鳟,该基因在240—330 dpf阶段的表达量显著上升.在同一发育阶段中,spindlin基因在二倍体雌性虹鳟卵巢中的表达量较三倍体雌性虹鳟相对较高,且均存在极显著差异(P<0.01).通过免疫组化结果发现,二倍体雌性虹鳟在240 dpf阶段,Spin蛋白在初级卵母细胞核内信号最强,在270—330 dpf阶段逐渐减弱;三倍体虹鳟卵巢在240—330 dpf发育阶段,在卵原细胞中信号逐渐增强.减数分裂异常是性腺败育的关键原因,研究结果表明三倍体虹鳟在减数分裂过程中出现异常与spindlin基因的低表达有关,这可能是卵巢发育阻滞的原因之一.

目的 采用生物信息学方法预测羊种布鲁氏菌BP26蛋白的抗原表位.方法 从NCBI数据库中获取羊布鲁氏菌的BP26蛋白的氨基酸序列,利用ExPASy蛋白分析在线软件ProtParam、SOPMA、SWISS MODEL,ProtScale、Signal 5.O、TMHMM2.0、PSOTR,分析BP26蛋白的理化性质,二、三级结构,亲、疏水性,信号肽,跨膜区及亚细胞定位;使用IEDB分析BP26蛋白的B细胞表位;使用PROSITE SCAN分别BP26蛋白的结构域分析.结果 BP26蛋白由250个氨基酸组成,分子式为C1152H1898 N328O364S12,相对分子质量为26.5×103,理论等电点为6.39,不稳定系数为27.93,为稳定蛋白.二级结构以α-螺旋为主,占41.2％;无规卷曲占36.8％,延伸链占17.2％;β-转角占4.8％.预测其三级结构与同源模板S19株BP26蛋白相似性99.55％,16个BP26分子形成一个新颖的通道状结构.BP26蛋白存在1个跨膜区,该跨膜区域位于7-29位氨基酸,可能为信号肽,与信号肽分析结果一致.Signal 5.0分析BP26蛋白在7-29位氨基酸有一个分泌型蛋白信号肽.BP26蛋白包含有14个线性表位,其中以27-42、108-125,224-240位氨基酸区段为BP26蛋白的优势抗原表位区段.BP26蛋白包含2个N-糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化作用位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点,5个N-豆蔻酰基化位点;亚细胞定位分析BP26蛋白为膜周质蛋白.结论 生物信息学分析羊种布鲁氏菌BP26蛋白存在多个B细胞抗原表位,可以作为布鲁氏菌诊断和疫苗研究的候选抗原.

目的 克隆荆芥1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,StDXS)基因,并进行生物信息学分析.方法 根据荆芥转录组数据获得的StDXS基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术获得StDXS基因cDNA的全长序列,并进行生物信息学分析.结果 荆芥StDXS基因全长2177bp,包含一个长度为2157 bp的开放阅读框,编码718个氨基酸,其理论相对分子质量为77 240,等电点为6.32,定位于叶绿体,不存在跨膜区及信号肽,为非分泌蛋白.同源系统进化树分析表明,该序列与同科植物鼠尾草的DXS基因进化关系较近,均属于DXS1亚家族.密码子偏性分析表明,该基因偏好使用以A/T结尾的密码子,具有28个偏性密码子,烟草为该基因最适合的外源表达宿主.结论 成功克隆荆芥StDXS基因并进行生物信息学分析,为从分子水平调控荆芥的生长发育和改善药材产量和品质提供理论基础.

目的:探究双氯芬酸小肠黏膜损伤对大鼠结肠黏膜内跨细胞白蛋白转运和肠道屏障功能的影响.方法:60只SD雄性大鼠,体质量240～280 g,随机分为三组各20只:对照组、T1组和T2组.对照组不实施任何干预;T1组大鼠双氯芬酸7.5 mg/kg灌胃后处死;T2组双氯芬酸15 mg/kg灌胃后处死.根据小肠损伤程度病理评分,对大鼠小肠的损伤程度进行评价.测定大鼠血清中一氧化氮(NO)的含量,血清白蛋白的含量,研究大鼠肠黏膜中白蛋白跨细胞转运的情况.测量各组大鼠小肠绒毛高度、肠腺隐窝深度、黏膜厚度以及绒毛表面积和小肠黏膜CD3+、CD4+、CD8+和IgA+细胞数.结果:①小肠损伤程度病理评分结果:双氯芬酸能够引起大鼠小肠黏膜严重损伤,可见糜烂、溃疡、红斑,局部的肠腔见囊样扩张,T1、T2组大鼠小肠的损伤程度均大于对照组(P＜0.05),T2组大鼠小肠的损伤程度大于T1组(P＜0.05).②T1组大鼠血清NO含量低于对照组(P＜0.05),T2组大鼠血清NO含量高于对照组(P＜0.05).T1、T2组大鼠血清白蛋白的含量低于对照组(P＜0.05),T2组较T1组的血清白蛋白含量降低(P＜0.05).③荧光标记蛋白结果:肠系膜上动脉缺血再灌注提高肠血管壁对荧光标记白蛋白的通透性,T2组较T1组的效果显著(P＜0.05).T1、T2组大鼠相关参数低于对照组(P＜0.05),T2组低于T1组(P＜0.05).④T1、T2组大鼠小肠黏膜CD3+、CD4+、CD8+和IgA+细胞数低于对照组(P＜0.05),T2组低于T1组(P＜0.05).结论:双氯芬酸性损伤诱发的结肠黏膜损伤随着时间的延长而加重;血清中的NO含量在大鼠双氯芬酸性损伤后呈先下降、后上升的趋势;双氯芬酸性损伤可使大鼠血清中血清白蛋白含量降低,同时增加肠黏膜的通透性,说明双氯芬酸性损伤会影响大鼠肠黏膜内跨细胞白蛋白的转运,从而导致肠道屏障功能障碍.