为探究CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建烟草突变体库的可行性,该研究以烤烟品种'红花大金元'为实验材料筛选了 100 个可能参与烟草香气代谢的基因,设计相应的 100 个 sgRNA 并构建了由 100 个CRISPR/Cas9 编辑载体组成的质粒库,获得转基因材料后分析了载体的共转化率、靶向编辑率和脱靶编辑情况.结果表明:(1)通过农杆菌介导 100 个sgRNA的共转化后,在 172 个阳性转化株中检测到了其中的77 个sgRNA,共转化率为 77%.(2)在 77 个携带sgRNA的转基因后代中,69 个sgRNA对目标基因进行了靶向编辑,编辑率为 89.6%.(3)脱靶位点测序检测发现,只有 1 个sgRNA在非目标靶位点产生了脱靶编辑,表明CRISPR/Cas9 基因编辑技术在烟草中的脱靶概率非常低.综上所述,利用CRISPR/Cas9 载体库共转化对烟草基因进行高通量靶向编辑以构建突变体库的方法切实可行,并且该方法有共转化率高、编辑率高和脱靶编辑概率低等特点.

由于工业发展以及生活废弃物污染的不断加剧,作物中的重金属浓度超标,严重威胁人体的健康.铝激活苹果酸转运体编码一类阴离子通道蛋白,在植物有机酸的跨膜转运中发挥重要的作用.为研究GmALMT33基因在大豆应对镉胁迫中的功能,本研究以大豆黑农48的叶片cDNA为模板,利用RT-PCR克隆得到GmALMT33基因.该基因CDS区全长1622 bp,编码553个氨基酸,含有1个ALMT结构域.qRT-PCR结果表明,GmALMT33在大豆根部的表达水平最高;镉胁迫后,该基因表达量呈现先升高后降低的趋势.构建植物表达载体pCPB-GmALMT33并对烟草、大豆毛状根进行遗传转化,转基因植株抗逆表型与生理指标分析表明,镉(66pmol/LCdCl2)胁迫下,转基因烟草叶片黄化、褪绿,边缘褐化程度明显低于野生型烟草.转基因大豆毛状根复合体植株茎秆和叶脉呈现的红褐色毒害症状程度明显弱于转空载体植株.在镉胁迫处理7d后,转基因烟草叶片的超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶活性及可溶性糖含量均高于野生型对照,丙二醛含量均低于对照.在镉胁迫处理0 d、1 d、3 d后,转基因大豆毛状根复合体根和叶的超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶活性、可溶性糖含量均高于转空载体对照,丙二醛含量均低于对照,表明GmALMT33基因提高了植株的耐镉能力.本研究为进一步探讨GmALMT33基因的作用机制提供了依据,并为大豆抗逆育种提供了新的基因.

[目的]单半乳糖甘油二酯合酶(MGD)是合成单半乳糖甘油二酯(MGDG)的关键酶,在植物响应低磷胁迫过程中起着重要作用.为系统了解水稻OsMGD2和OsMGD3基因在低磷胁迫响应中的作用和功能.[方法]用盆栽试验分析正常和低磷条件下野生型(SR1)、过表达OsMGD2和OsMGD3转基因烟草的生理响应及脂质组分的变化.[结果]无论在正常还是低磷条件下,转基因与野生型烟草的磷含量无显著差异,但转基因烟草的生物量、叶绿素含量和光合能力均显著高于野生型.转基因烟草在低磷胁迫下的磷脂(PL)含量、双半乳糖甘油二酯(DGDG)含量、DGDG与MGDG的比值和半乳糖脂(GL)与PL的比值均显著高于野生型烟草,且OsMGD3转基因烟草的脂质含量和比值均高于OsMGD2转基因烟草.[结论]通过调控水稻OsMGD2/3基因表达,可提高植物低磷下的膜脂重塑能力,进而维持植物在低磷胁迫下较高的光合和生长能力,增加植物的低磷耐受性.

干旱和土地盐渍化是制约林业可持续发展的重要因素,植物在遭受生物或非生物胁迫时,会在叶片释放萜类等挥发性物质.1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)是MEP 途径的末端活性酶,具有提供前体萜类物质和主要限速作用.为探究马尾松HDR基因是否参与干旱和盐胁迫条件下的胁迫响应,该研究克隆了马尾松HDR基因开放阅读框,并初步分析了其生物信息、组织特异性表达水平和初步功能.结果表明:(1)PmHDR基因编码区长度为1 458 bp,编码485 个氨基酸,其编码蛋白包含LytB/IspH基因超家族的核心序列和PLN02821 多功能结构域,属于HDR家族.(2)PmHDR密码子使用偏好性较弱,偏好使用A/U结尾的密码子,烟草、拟南芥与酿酒酵母更适合作为其异源表达受体.(3)qRT-PCR结果显示,PmHDR基因在马尾松老叶中表达量最高,其次为幼叶、幼茎和老茎,在根中表达量最低.(4)构建基因表达载体pBI121-PmHDR并转化拟南芥,转基因拟南芥对干旱和盐胁迫表现出更强的抗逆性.以上研究结果表明PmHDR参与了植物干旱和盐胁迫的响应和调节,并为马尾松抗逆育种提供了一定的理论支持.

[目的]HD-Zip(Homeodomain and Leucine zipper)家族是植物特有的转录因子家族之一,在植物的生长发育、逆境响应中发挥重要作用.从陆地棉全基因组范围内鉴定GhHDZ基因家族成员,分析相关基因表达特点,为后续深入研究提供支撑.[方法]利用生物信息学方法从陆地棉TM-1 基因组中鉴定出GhHDZ基因家族成员,并对其理化特性、系统进化关系、染色体定位、基因复制、基因结构和启动子区顺式作用元件等进行分析.利用转录组数据结合实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)分析GhHDZ家族基因在不同非生物胁迫下的表达模式.采用烟草瞬时转化法检测目标蛋白的亚细胞定位情况,通过转基因过表达方法验证目标基因功能.[结果]在陆地棉基因组中共鉴定到 205 个GhHDZ基因,系统发育分析将GhHDZ家族划分为 4 个亚组.片段复制是GhHDZ基因家族进化的主要原因,且该基因家族经历了强烈的纯化选择.在转录组分析基础上,对其中 10 个GhHDZ基因在 4 种非生物胁迫下的RT-qPCR鉴定分析表明,GhHDZ12、GhHDZ46、GhHDZ119 正向响应冷胁迫,GhHDZ15、GhHDZ188 负向响应冷胁迫;GhHDZ15、GhHDZ46、GhHDZ50、GhHDZ76、GhHDZ116、GhHDZ146、GhHDZ176、GhHDZ188 正向响应热胁迫;GhHDZ15、GhHDZ50、GhHDZ76、GhHDZ116、GhHDZ119、GhHDZ146、GhHDZ176、GhHDZ188 正向响应盐胁迫;GhHDZ12、GhHDZ15、GhHDZ50、GhHDZ116、GhHDZ119、GhHDZ176、GhHDZ188 正向响应干旱胁迫,GhHDZ76 负向响应干旱胁迫,且发现上述基因对各种胁迫的响应时间各有差异.进一步对GhHDZ146 的功能研究发现,该基因定位于细胞核,在拟南芥中异源过表达显著增强了对盐胁迫的耐受性.[结论]在全基因组范围内从陆地棉中系统鉴定出205 个GhHDZ家族成员.不同基因对各种胁迫的响应不一,且表达模式存在差异.GhHDZ146对盐胁迫具有正向响应功能.

[目的]日本落叶松黄烷酮 3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase 2,LkF3H2)基因在类黄酮生物合成过程中发挥着重要的调控功能.探究LkF3H2 基因在日本落叶松中发挥的具体功能和植物类黄酮生物代谢过程.[方法]根据实验室前期转录组数据克隆日本落叶松LkF3H2 基因并进行生物信息学分析及组织表达分析.随后将该基因转化烟草进行转基因烟草组织表达分析及类黄酮含量测定,以探究基因表达量与类黄酮含量之间的关系.[结果]LkF3H2 基因cDNA序列长度为 1074 bp,其蛋白编码 358个氨基酸,分子式C1785H2807N481O541S18,分子量为 40.24 kD,该蛋白是不稳定的亲水性蛋白且不含信号肽;同时系统进化分析得出日本落叶松LkF3H2 与火炬松、辐射松、白云杉和欧洲云杉F3H亲缘关系较近并且该蛋白含有保守结构域 2OG-Fe(Ⅱ)oxygenase superfamily,属于 2-酮戊二酸依赖性双加氧家族.另外组织表达分析显示LkF3H2 基因在一月龄日本落叶松幼苗叶中表达量最高,在一年生日本落叶松幼苗茎中表达量最高,并且在转基因烟草叶中也显示了最高的表达量.值得一提的是,转基因烟草叶中的类黄酮含量也是最高的,其次为茎和根,转基因烟草中类黄酮含量与LkF3H2基因表达量呈正相关关系.[结论]日本落叶松LkF3H2基因属于 2-酮戊二酸依赖性双加氧家族并且在类黄酮生物合成过程中发挥着重要功能.

番茄转录因子S1NAC1调控多种生物和非生物胁迫应答,但其上游转录调控因子至今不明,限制了对其胁迫应答机制的理解.构建了系列5'-缺失的SlNAC1启动子(起始密码子上游2 039 bp、1 508 bp、1 373 bp和777 bp)驱动的GUS转基因烟草,并定量分析了其在低温、高温和ABA诱导下的GUS酶活,以鉴定SlNAC1启动子中的低温、高温和ABA应答顺式元件.结果显示,低温和高温诱导后,2 039 bp启动子转基因烟草GUS酶活的增长显著高于其他转基因烟草和野生型烟草;而ABA诱导后,1 508 bp启动子转基因烟草GUS酶活的增长显著高于其他转基因烟草和野生型烟草.这些结果说明低温和高温应答顺式元件位于-2 039～-1 508 bp区间,而ABA应答顺式元件位于-1 508～-1 373 bp区间.启动子顺式元件预测分析显示,-2 039 bp～-1 508 bp区间只有1个低温/高温/干旱/盐应答顺式元件DRE/CRT,而-1 508 bp～-1 373 bp区间只有1个ABA应答顺式元件ABRE.因此,这两个顺式元件将作为候选元件用于后续SlNAC1上游调控转录因子的筛选.

探究逆境诱导启动子RD29A对转雪莲SikCDPK1 基因烟草抗逆性的影响,为SikCDPK1 基因在植物遭遇低温、干旱时更好发挥作用奠定基础.采用基因重组技术构建RD29A启动子驱动SikCDPK1 基因的植物表达载体,通过农杆菌介导法遗传转化烟草,分别观察、测定和比较分析低温、干旱处理后,RD29A∷SikCDPK1 转基因烟草、35S∷SikCDPK1 转基因烟草和非转基因烟草的表型、POD活性、SOD活性、叶绿素含量、MDA含量和相对电导率的差异.结果显示,干旱和低温胁迫后,RD29A∷SikCDPK1 转基因烟草的生长状况优于 35S∷SikCDPK1 转基因烟草,更优于非转基因烟草;同时,RD29A∷SikCDPK1 转基因烟草的POD活性、SOD活性、叶绿素含量显著高于 35S∷SikCDPK1 转基因烟草,极显著高于非转基因烟草;但MDA含量与相对电导率显著低于 35S∷SikCDPK1转基因烟草,极显著低于非转基因烟草.表明启动子RD29A可通过减缓叶绿素降解速率、提高抗氧化系统酶活性、减小膜通透性,使转基因烟草表现出更强的干旱、低温耐受性.

天然除虫菊酯是从除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)中提取的绿色植物源生物杀虫剂.醛脱氢酶(TcALDH)和GDSL脂肪酶(TcGLIP)是除虫菊酯生物合成途径中的关键限速酶.为探究TcALDH和TcGLIP基因的功能,该研究从除虫菊无性系'W99'中克隆得到TcALDH和TcGLIP基因的启动子,并通过生物信息学分析、组织化学染色(GUS染色)、荧光素酶报告实验和外源植物激素处理实验对其启动子的调控元件、启动子活性、激素诱导特异性和组织特异性进行分析.结果表明:(1)克隆得到的TcALDH和TcGLIP启动子序列分别为2 848、1 343 bp,均含有多个与逆境应答和激素信号相关的顺式作用元件.(2)分别构建了启动子和荧光素酶融合的植物表达载体,在烟草叶片中观察荧光成像发现,TcALDH 启动子具有茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)激素诱导特异性.(3)用MeJA和ABA处理除虫菊'W99'组培苗发现,TcALDH的表达量在 12h内受ABA诱导时上调,受MeJA诱导时先升高后降低,TcGLIP的表达量受ABA和MeJA诱导下调.(4)分别构建了TcALDH和TcGLIP启动子与GUS基因融合的植物表达载体,转化烟草并对其转基因叶片进行GUS活性染色发现,TcALDH启动子在烟草叶片腺体、腺毛头部及叶肉细胞中表达,而TcGLIP启动子仅在烟草叶肉细胞中表达.综上认为,TcALDH和TcGLIP的启动子具有组织特异性,TcALDH启动子具有MeJA和ABA激素诱导特性.该研究结果为除虫菊TcALDH和TcGLIP基因参与除虫菊酯合成的调控机制提供了新见解.

目的 提取高表达花烟草防御素1(Nicotiana alata defensin 1,NaD1)基因的K326烟草叶片总蛋白,并分析其生物活性.方法 从花烟草花、野生型(WT)和高表达NaD1基因(转基因)K326烟草叶片中提取总蛋白,Bardford法测定蛋白浓度.滤纸片法检测总蛋白对真菌的抑菌活性,CCK-8法检测对癌细胞(HeLa细胞)的抑制活性.结果 花烟草花、WT及转基因K326烟草叶片总蛋白浓度分别为11.25、10.33和10.14 mg/mL.转基因K326烟草叶片总蛋白对白色念珠菌的抑菌活性为(85.68±3.08)％,分别为WT K326烟草叶片和花烟草花总蛋白的1.33和1.14倍(F=15 339,P＜0.05);对尖孢镰刀菌的抑菌活性为(148.48±2.47)％,分别为WT K326烟草叶片和花烟草花总蛋白的1.09和1.08倍(F=4 927,P＜0.05).转基因K326烟草叶片总蛋白对HeLa细胞的IC50最小(6.11 mg/mL),抑制活性分别为WTK326烟草叶片和花烟草花总蛋白的1.56和1.21倍(F=89748,P＜0.05).结论 高表达NaD1基因的K326烟草总蛋白具有良好的抑菌和抗癌生物活性,本研究为以烟草作为生物反应器生产抑菌和抗癌生物制剂提供了实验依据.