目的 对17株来源于我国华东与华南地区的养殖鱼类迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)分离株进行多样性分析.方法 通过菌体血清凝集试验及16S rRNA与hsp60部分基因序列的聚类分析.结果 菌体血清凝集试验结果显示,鳗源迟缓爱德华氏菌ETY的抗O血清可凝集大部分鱼源迟缓爱德华氏菌;人源迟缓爱德华氏菌标准株ATCC15947的抗O血清仅与鱼源迟缓爱德华氏菌WY37有交叉凝集;鲶鱼爱德华氏菌EIV的抗O血清与鱼源迟缓爱德华氏菌无交叉凝集.2株鱼源迟缓爱德华氏菌AL60306NA1和E29L与以上3种爱德华氏菌抗O血清不发生凝集反应.基于16S rRNA及hsp60部分基因序列构建的系统发育进化树显示,来源于不同地区的绝大部分鱼源迟缓爱德华氏菌分离株进化同源性较高,在基于16 S rRNA构建的系统进化树中,山东地区分离自大菱鲆的迟缓爱德华氏菌聚为一支.3株鱼源迟缓爱德华氏菌AL60306NA1、E29L、GK4与人源迟缓爱德华氏菌ATCC15947及人源鲶鱼爱德华氏菌EIV有一定亲缘关系.结论 我国华东、华南地区的鱼源迟缓爱德华氏菌分离株普遍具有相似的血清型和较高的进化同源性,并与人源的迟缓爱德华氏菌、人源的鲶鱼爱德华氏菌有明显差异.个别鱼源迟缓爱德华氏菌血清型与分子系统进化分析结果不一致,提示在防控鱼类爱德华氏菌病时,应将菌体表面抗原的免疫原性与分子聚类分析相结合.

实验构建了大鲵短型肽聚糖识别蛋白PGRP-S的真核表达质粒, 并对其功能进行了初步的研究.序列分析显示, 所克隆的大鲵PGRP-S的N端不含有信号肽; 其编码的氨基酸序列具有2个相距较近的半胱氨酸残基以及2个Zn2+结合位点.Western-blotting检测结果显示大鲵PGRP-S既可分泌到胞外, 也可滞留在胞内.体外抗菌实验的结果表明,过表达大鲵PGRP-S能显著抑制迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)在HEK293T细胞内和胞外培养基中的增殖.此外, 过表达大鲵PGRP-S能诱导NF-κB启动子的活性; 能结合Lys-type和Dap-type的肽聚糖但不能降解它们.研究结果表明大鲵PGRP-S在功能上类似于哺乳动物而有别于硬骨鱼类短型的肽聚糖识别蛋白.

[目的]从健康尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 肠道中筛选一株对罗非鱼源无乳链球菌等病原菌具有拮抗功能的益生菌.[方法]取健康尼罗罗非鱼肠道, 匀浆后进行10倍系列梯度稀释, 然后涂布BHI平板, 培养1–2d, 挑取单克隆菌落.采用点种法初步筛选对罗非鱼源无乳链球菌有拮抗作用的菌株, 选取其中一株拮抗效果较好的菌株LF01, 通过形态学、生理生化特征以及分子生物学分析, 对LF01菌株进行鉴定.然后对LF01菌株的生长特性、水解淀粉和酪蛋白能力、药物敏感特性、抗菌谱和生物安全性进行测定和分析.[结果]根据菌落形态和生长时间的差异, 从健康尼罗罗非鱼肠道中筛选出64株细菌, 通过拮抗试验筛选出6株具有明显拮抗效果的菌株, 其中LF01菌株的拮抗效果最好.根据LF01的形态、生理生化特征和gyr A基因的进化分析, 确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillus velezensis) .LF01菌株的最适生长温度为30°C, 最适p H值为7, 最适盐度为5‰, 而且该菌株具有水解淀粉和酪蛋白的功能.药敏试验结果显示, LF01菌株对多数抗生素敏感, 仅对杆菌肽耐药.拮抗试验结果显示LF01株对无乳链球菌、海豚链球菌、迟缓爱德华氏菌、鮰爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌、维氏气单胞菌、简氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌等病原菌均具有拮抗作用, 其中对鰤鱼诺卡氏菌的拮抗作用最强, 平均抑菌圈直径达28.3 mm.生物安全试验表明, LF01菌株对尼罗罗非鱼、斑马鱼 (Danio rerio) 和乌鳢 (Channa argus) 等3种鱼均无致病性, 具有良好的安全性.[结论]本研究筛选了一株贝莱斯芽孢杆菌LF01株, 该菌的生物安全性良好, 而且可拮抗常见的水产病原菌, 具有防控多种水产经济动物疾病的潜力, 应用前景十分广阔.

目的 Eha是一种重要转录调控因子,它可以影响迟缓爱德华氏菌(Et)的胞内存活,本实验探究Eha直接调控的靶基因如何抵御巨噬细胞杀灭细菌的分子机制.方法 构建pGEX-4T-ehaflag重组质粒,电击导入eha基因缺失株的ET-13菌,得到Cehaflag ET13重组菌;用Western blot检测重组菌Eha-Flag融合蛋白的表达,并用细菌胞内存活实验检测细菌EhaFlag融合蛋白的活性;我们采用染色质免疫共沉淀(CHIP)技术,用抗Flag标签抗体对靶基因沉淀Eha DNA片段,除去结合的蛋白并纯化DNA片段;以RNA-Sequencing的差异表达基因设计引物,以CHIP得到的DNA样品为模板,进行qRTPCR;PCR扩增靶基因的启动子区域,构建了pBAD-P靶 lac Z重组质粒,电击分别导入ET 13野生株和eha基因缺失株,比较它们β-半乳糖苷酶活性的差异;SDS-PAGE电泳比较野生株和缺失株外膜蛋白、厌氧C4二羧酸转运蛋白DcuA1和鞭毛钩蛋白FlgK表达的差异,并用细菌胞内存活实验比较野生株和缺失株的差异.结果 Western blot表明,Cehaflag ET13重组菌能够表达Eha-Flag融合蛋白;细菌胞内存活实验表明,该融合蛋白完全可以恢复缺失株在胞内降低的生存能力,Flag融合标签不影响Eha蛋白的功能;通过qPCR鉴定CHIP,富集到Eha的结合靶点,最终筛选出1 0个Eha直接结合的基因;通过野生株和缺失株中β半乳糖苷酶活性的差异,证明eha基因对5个靶基因启动子有直接调控作用;通过检测野生株和缺失株表型的差异,证明eha基因对靶蛋白DcuA1,TnaA和FlgK的表达和活性有调控作用.结论 Eha可以通过直接调控这些靶基因,使Et菌在巨噬细胞内的存活受到影响.

[目的]在真核毕赤酵母KM体系中表达黄鳝NK-lysin抗菌肽,并检测体外抗菌活性.[方法]利用特定引物扩增黄鳝NK-lyin抗菌肽基因片段,将黄鳝NK-lysin基因片段插入pPIC9K真核表达质粒中,通过PCR与测序验证阳性克隆,成功构建重组黄鳝NK-lysin与pPIC9K真核表达质粒,将线性化的NK-lysin-pPIC9K电击转化到毕赤酵母细胞KM71获得重组酵母KM71-NKlysin,通过PCR验证,对重组酵母进行发酵,并收集酵母上清液同时检测体外抗菌活性.[结果]成功构建重组酵母KM71-NKlysin表达体系,酵母表达体系上清液对迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、乳酸菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌均有明显抑制作用.[结论]重组表达黄鳝抗菌肽蛋白对水环境大多数细菌具有明显抑菌活性,对于黄鳝疾病预防具有广阔应用前景.

养殖美洲黑石斑(Centropristis striata)发生以“内脏白点”为主要临床症状的暴发性死亡,为明确美洲黑石斑患病原因,对患病鱼进行了病原分离、鉴定及致病性研究,以期为防治美洲黑石斑迟缓爱德华氏菌病提供参考依据.患病的美洲黑石斑的症状主要表现为鳃和内脏组织如脾脏及肾脏上布满白点.从患病鱼的病灶处分离纯化到一株优势致病菌株(ZS201807),通过对该菌株形态特征、生理生化特性和16S rDNA基因测序等综合分析,鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda).人工感染实验证实此菌株可引起健康美洲黑石斑发病并表现出与自然发病相似的症状.利用组织切片和电镜超薄切片技术对患病美洲黑石斑鱼的肝脏、脾脏、鳃丝等6种组织进行组织病理学分析.组织病理结果显示,脾和肾是感染较严重的主要靶器官,脾脏组织内大量红细胞浸润,出现严重瘀血;鳃丝毛细血管扩张;肾小管管腔狭窄,肾小球肿大,上皮细胞肿胀,细胞空泡化.超微病理显示,病鱼脾脏和头肾组织有大量杆状细菌积聚.药敏试验发现该菌对环丙沙星(5μg/片)、四环素(30μg/片)、恩诺沙星(5μg/片)等14种药物敏感;对青霉素(10U/片)、阿奇霉素(15μg/片)、丁胺卡那(30 g/片)等13种药物耐受.证实此次养殖美洲黑石斑发病死亡的病原菌为迟缓爱德华氏菌.

[目的]以黄河鲤为材料,从其肠道内分离具有产β-甘露聚糖酶功能的益生菌.[方法]采用平板水解圈法初筛,摇瓶发酵法复筛获得产β-甘露聚糖酶的菌株,通过形态学观察、生理生化试验、16SrRNA基因序列和比较基因组分析对该菌株进行鉴定,并用DNS定糖法测定酶学活性,用耐高温、耐酸、耐胆盐和平板打孔扩散法对其益生特性进行研究,用滤纸片法、腹腔注射法等对其生物安全性进行评价.[结果]本研究通过刚果红染色从鲤肠道中分离筛选出产β-甘露聚糖酶的细菌62株,其中HF-14109菌株产酶能力最强.通过形态学观察、生理生化试验、16S rRNA基因序列和比较基因组分析对该菌株进行鉴定,确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis).酶学性质研究发现,该酶最适反应温度为45℃、最适pH为6.0,在温度20-80℃、pH 4.0-9.0范围内都较为稳定;Cu2+、Fe3+、Zn2+、Ba2+对该酶具有激活作用,而Mn2+、Ca2+对该酶具有抑制作用;对魔芋粉、瓜尔胶和槐豆胶都有较好的降解能力.生物学特性研究表明,HF-14109对酸、高温、胆盐具有较好的耐性,对大肠杆菌(Escherichia coli)EC 05、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)ET 03、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)SA 16、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)Ah 01等均有抑制作用.安全性评价显示,用107、108、109浓度HF-14109菌悬液对黄河鲤腹腔注射后,未出现死亡及异常状况;该菌株对庆大霉素、卡那霉素、克林霉素、氯霉素、红霉素、链霉素、四环素、万古霉素、氨苄西林等均不具有耐药性.[结论]本研究从黄河鲤(Cyprinus carpio)肠道筛选到一株产β-甘露聚糖酶的贝莱斯芽孢杆菌HF-14109,具有较高的酶活性和良好的酶学性质、益生特性和安全性,可作为潜在消除水产饲料中甘露聚糖抗营养因子的功能益生菌.