目的:探索基于显微注射方法构建胶质母细胞瘤(GBM)融合大脑类器官模型的可行性，观察该模型肿瘤组织对替莫唑胺(TMZ)的敏感性。方法:GBM组织和脑肿瘤旁组织标本(定义为正常脑组织)来源于中南大学湘雅医院神经外科行手术治疗的患者。采用绿色荧光蛋白(GFP)标记过的人诱导多能干细胞株(hiPSCs)培养24 d构建大脑类器官模型，通过免疫荧光染色方法检测蛋白标志物的表达，评估模型是否成功建立。采用显微注射方法将用红色荧光染料标记过的患者来源的GBM单细胞或U-251 MG细胞株注射到培养约30 d的大脑类器官中，构建GBM融合大脑类器官模型。采用免疫荧光染色法、HE染色等方法观察GBM细胞在大脑类器官中的增殖及浸润情况。采用免疫荧光染色法检测GBM融合大脑类器官中肿瘤细胞基质金属蛋白酶类(MMPs)及BrdU的表达情况，采用HE染色观察形态及结构变化。将10 μmol/L TMZ加入GBM融合大脑类器官模型及GBM肿瘤类组织中培养48 h，采用免疫荧光染色法检测两种模型中Caspase-3的表达。结果:(1)hiPSCs培养至第24天，形成具有明确芽和分层边缘的块状组织样结构；免疫荧光染色显示，该结构阳性表达前脑、脑室样结构、前额叶皮质及海马的标志蛋白FOXG1、N-cadherin、Auts2及Frizzled 9，以及星形胶质细胞标志蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元标志蛋白TUJ1。(2)荧光显微镜下及HE染色均显示肿瘤细胞在大脑类器官内快速增殖，呈浸润性生长。免疫荧光检测显示，与大脑类器官比较，GBM融合大脑类器官的肿瘤细胞中，MMP2和MMP13的表达明显增加，Fibronectin、MMP3及MMP9的表达明显减弱，差异均有统计学意义(均 P<0.05)，MMP10的表达差异无统计学意义( P>0.05)；GFAP和BrdU的表达水平均增高(均 P<0.05)。(3)TMZ处理48 h后，免疫荧光染色显示，GBM类肿瘤组织中Caspase-3的表达明显高于GBM融合大脑类器官。 结论:采用显微注射方法能够成功构建GBM融合大脑类器官模型。该模型中的肿瘤组织对TMZ的敏感性低于GBM肿瘤类组织。

目的 考察不同生境土壤元素对冷蒿有效成分含量的影响.方法 土壤农化法测定大量元素(N、P、K)、中量元素(Ca、Mg、Si)、微量元素(Fe、Mn、Zn、Cu、B)的含量,分光光度法、酸性染料比色法分别测定总黄酮、总生物碱的含量,再进行简单相关分析、偏相关分析、通径分析.结果 荒漠草原、沙地土壤培育的冷蒿中有效成分含量最高,Ca、Mg含量是影响总黄酮积累的正向土壤元素,前者对后者有拮抗作用;B含量与总生物碱积累存在显著正相关关系(P<0.01).结论 本实验分析了根际土壤元素与冷蒿品质的关系,旨在明确对药材品质形成影响较大的有效元素,为其规范化开发种植、科学施肥提供理论依据.

目的:优选镰形棘豆总生物碱的提取工艺.方法:在单因素考察的基础上,选择溶剂用量、超声时间、乙醇体积分数为自变量,以镰形棘豆中总生物碱含量为因变量,采用星点设计-效应面法优选出镰形棘豆总生物碱的最佳提取工艺.结果:最佳提取工艺条件为加入36倍量72%乙醇(含1%乙酸),在60℃下超声提取2次,每次77 min,总生物碱的含量为2.793 mg·g-1,与预测值比较偏差小于2%.结论:星点设计-响应面法优化镰形棘豆总生物碱的提取工艺方法简单,精密度高,模型可靠,可预测性趋势良好.

目的:对合江金钗石斛3个品系(JC-1,JC-2,JC-3)主要农艺性状与品质进行比较,为合江金钗石斛生产提供指导,为金钗石斛新品种选育提供参考依据.方法:用直尺、游标卡尺和分析天平等测定了合江金钗石斛的主要农艺性状与产量性状;采用苯酚-硫酸比色法和酸性染料比色法分别测定茎中多糖与总生物碱含量.结果:2年生的JC-1在茎节数、节间长、茎鲜重与茎干重方面表现最佳.从茎长来看,无论是1年生,2年生还是3年生,均表现为JC-1＞ JC-2＞ JC-3.茎粗则随着年限的增长而增粗,JC-2粗于JC-1和JC-3,且JC-2从2年生到3年生这个阶段增长迅速.折干率均表现为2年生大于1年生与3年生,JC-1的折干率远大于JC-2与JC-3.JC-3株型最小,折干率最低.在有效成分含量方面,多糖质量分数为JC-1(4.64％)＞JC-2(3.02％)＞JC-3(2.20％);总生物碱质量分数为JC-3(0.59％)＞JC-2(0.48％)＞JC-1 (0.45％),但折算为茎鲜品中多糖与总生物碱含量均为JC-1最高.结论:综合生产及品质等角度,笔者认为合江金钗石斛品系JC-1最适合推广种植.

目的 对不同居群野罂粟Papaver nudicaule的全草及不同部位(根、茎、叶、花、果)总生物碱及3种主要生物碱(野罂粟碱、黑龙辛甲醚、瑞芙热米定)进行测定,为野罂粟药材的科学利用与质量评价提供科学依据.方法 采用HPLC-MS-IT-TOF法对野罂粟全草进行定性分析,分别采用溴甲酚绿酸性染料比色法和UPLC-MS法对野罂粟的总生物碱及3种主要生物碱进行定量测定.结果 通过定性分析,初步得到13个生物碱成分,基本确定了其中6个主要生物碱成分;定量分析结果表明,各成分的量均表现出较大的变异性,其中以乌兰布统、黄岗梁和多伦地区的综合品质较好,其中乌兰布统的野罂粟品质最佳;并且其全草和花中所含有的生物碱类成分量最高.结论 评价野罂粟品质特征时建议以总生物碱和野罂粟碱为主要参考指标;建议选择乌兰布统、黄岗梁和多伦开展野罂粟优良品种选育和药材质量标准制定及道地产地规划等研究,而最佳采收期应选在7月下旬至8月上旬为宜,采收部位应选择花和全草.

甾体生物碱是天然甾体的含氮衍生物,在化学特性和生物活性方面具有甾体类和生物碱类化合物的双重属性.甾体生物碱是贝母、黄杨、藜芦、龙葵等传统中药中的主要药效成分,并且也存在于马铃薯、蕃茄、茄等常用食物中.现代药理学研究表明,甾体生物碱类成分在抗肿瘤、心血管系统、抗菌、杀虫等方面具有很强的活性,同时也具有较强的毒性.甾体生物碱因其结构的特殊性,对其定量分析造成一定难度.对1998-2017年相关文献中甾体生物碱类成分的定量分析方法进行综述,其中应用于甾体生物碱总含量的测定方法主要有分光光度法-酸性染料比色法、酶联免疫吸附法、滴定法等;特定甾体生物碱的含量普遍采用高效液相色谱法,主要包括HPLC-UV,HPLC-ELSD,HPLC-MS和HPLC-CAD等.本文对近20年甾体生物碱定量分析的相关研究进行了归纳,并对各种含量测定方法的优势和局限性加以总结,以促进对相关中药质量以及相关食物安全性控制方法的改进和提升,同时也为甾体生物碱类成分以及相关中药的进一步开发利用提供分析方法方面的参考.

目的 确定大孔吸附树脂纯化延胡索总生物碱的工艺条件.方法 以酸性染料比色法测定延胡索总生物碱,HPLC法测定延胡索中盐酸巴马汀、脱氢紫堇碱、延胡索乙素及延胡索甲素:以延胡索总生物碱和4种生物碱的吸附率、洗脱率及质量分数为指标,利用静态吸附和动态吸附实验相结合的方法,对6种大孔吸附树脂进行筛选.通过考察上样量、体积流量、除杂溶剂和体积、洗脱溶剂和体积等因素,优选延胡索总生物碱纯化工艺条件,以5、10倍放大试验考察纯化工艺的稳定性.结果 选取D141型大孔树脂用于延胡索总生物碱纯化,纯化工艺为生药0.6 g/mL的上样液,加入径高比1:5～1:9的D141大孔吸附树脂柱,以体积流量2 BV/h上样2 BV,1.3 BV纯水除杂,6 BV 95％乙醇以2 BV/h体积流量洗脱.纯化后延胡索总生物碱质量分数高达68.19％,盐酸巴马汀、脱氢紫堇碱、延胡索乙素及延胡索甲素的质量分数分别为1.95％、11.74％、4.93％、6.36％.经5、10倍放大试验得到的延胡索总生物碱质量分数能达到65％以上.结论 该工艺经验证试验,总生物碱质量分数能达到65％以上,且延胡索总生物碱及4种生物碱单体的转移率均能达到85％以上,表明D141型大孔吸附树脂能有效纯化延胡索中总生物碱,且适用于工业大生产.

目的 癌症已成为威胁人类健康的最严重疾病之一,研发新型抗癌药,揭示其作用机制,具有重要医学意义.本研究报道了一种新型4,6-二氯靛红衍生物(FMDCIS)的抗癌活性及其作用机制.方法 利用酸性磷酸酶法检测FM-DCIS对癌细胞体外增殖的影响;观察在FMDCIS作用下人肝细胞癌HepG2细胞的形态变化;应用流式细胞术分析FMDCIS对细胞周期的影响;于25℃离心分离可溶性的微管蛋白二聚体与不溶的聚合微管蛋白,检测FMDCIS处理组和对照组HepG2细胞内微管组装水平的差异;蛋白质印迹法检测FMDCIS所致细胞周期和凋亡通路中关键调控蛋白的改变;荧光染料单丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)检测自噬小体的变化.结果 FMDCIS对人肝癌HepG2和BEL-7402细胞,以及小鼠乳腺癌4T1细胞均有显著的杀伤效果,其中对HepG2细胞的杀伤效果最强,其IC50为0.57μg/mL.而FMDCIS对人胎肝细胞L02的IC50为1.67μg/mL,明显高于HepG2细胞,表明FMDCIS对胎肝细胞的毒性相对较弱.光镜显示,FMDCIS作用后的HepG2细胞铺展能力丧失并变成圆形.流式细胞术检测结果显示,HepG2细胞在FMDCIS孵育6、12和24 h后,G2/M期占比分别为(10.2±0.5)％、(71.3±1.3)％、(82.3±1.2)％,与对照组相比差异有统计学意义,F=161.38,P<0.01,表明FMDCIS可将HepG2细胞阻断于G2/M期.此外,随着FM-DCIS作用时间的延长,G2/M峰左移,提示发生了染色体丢失和有丝分裂灾难.对照组HepG2细胞内可溶性微管蛋白与不溶性聚合微管蛋白之比值为1.01±0.02,而在FMDCIS给药组孵育24 h后,可溶性与聚合微管蛋白比值增加到2.01±0.23(F=10.38,P<0.01),表明FMDCIS具有秋水仙素样的抗微管药活性,可抑制细胞内微管组装.蛋白质印迹法检测结果显示,在FMDCIS作用下,HepG2细胞内周期蛋白Cyclin B1含量增高,F=13.16,P<0.01;Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A、c-Myc、E2F1和RB含量降低;Pro-Caspase-3和PARP均出现裂解带,促凋亡蛋白Bax上调(F=20.74,P<0.01),抑凋亡蛋白Bcl-2下调,F=18.38,P<0.01.MDC染色显示,在FMDCIS作用下HepG2细胞内自噬小体大量增加.结论 FMDCIS对人肝细胞癌HepG2细胞有很强的杀伤效果,其作用机制为抑制微管组装,干扰有丝分裂进程,导致细胞周期阻滞于有丝分裂前期,进而引发有丝分裂灾难,并以凋亡和自噬性细胞死亡同时活化的方式杀伤癌细胞.

目的 测定金花小檗根、茎和叶及根、茎提取物的总生物碱及其组分含量,研究根、茎提取物及组分对小鼠学习记忆能力和抗氧化能力的改善作用.方法 采用酸性染料比色法测定金花小檗根、茎、叶和根、茎提取物及组分的总生物碱含量,以HPLC法同时测定药根碱、巴马汀和小檗碱的含量.用东莨菪碱制备记忆障碍小鼠模型,ig不同剂量的金花小檗根、茎提取物及组分30 d,以跳台实验和水迷宫实验检测根、茎提取物及组分对小鼠学习记忆的影响,测定血清丙二醛(MDA)和总超氧化物歧化酶(T-SOD).结果 金花小檗提取物及水溶性组分显著延长小鼠跳台实验的潜伏期(P＜0.01),显著减少错误次数(P＜0.01);在一定程度上,缩短水迷宫的定位航行时间(P＜0.01),并显著减少错误次数(P＜0.05).根、茎提取物和水溶性组分能显著提高小鼠体内T-SOD活性(P＜0.05、0.01),而显著降低MDA水平(P＜0.05、0.01).结论 金花小檗根、茎提取物及水溶性组分对小鼠的学习记忆能力有一定的改善作用,对其体内抗氧化能力也有提高.

目的 比较有胆附片与无胆附片的成分异同,探讨胆巴炮制与无胆炮制对附子生物碱类成分的影响.方法 采用酸性染料比色法及高效液相色谱法对5种附子炮制品(生附片、黑顺片、熟附片、蒸附片、炒附片)的生物碱类成分进行分析.结果 江油产生附片质量最优,去皮可以提高附子中有效成分的相对含量;有胆炮制黑顺片、熟附片均能显著降低毒性成分双酯型生物碱的含量,但同时有效成分单酯型生物碱及总生物碱流失严重;无胆蒸制或炒制附片能有效去除毒性成分并保留有效成分,"去毒存性"能力较好.结论 不同炮制方法能不同程度地降低附子毒性成分双酯型生物碱含量,增加有效成分单酯型生物碱含量,达到增效减毒的目的;但有胆炮制附片存在炮制过度之嫌,无胆炮制工艺简便易行,不易引入无机杂质,具有推广和应用价值.