目的:探讨重组结核杆菌融合蛋白(recombinant myobacterium tuberculosis fusion protein,EC)皮肤试验在筛查肺结核患者密切接触者结核分枝杆菌感染中的实用性和有效性,为进一步优化结核感染检测提供技术建议,了解密切接触者结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)现状.方法:2023年10月23日至11月14日在上海市奉贤区和金山区共选取140名肺结核密切接触者作为研究对象,对每名研究对象同时采用γ-干扰素释放试验(IGRA)和EC皮肤试验进行结核感染检测,采用Kappa值检验两种方法结果一致性,采用x2检验比较两组检测方法之间的差异,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果:140名研究对象,包括男性55例,女性85例;IGRA阳性率为15.00％(21/140),EC皮肤试验阳性率为14.29％(20/140),两种试验方法一致性检验Kappa值为0.857,差异无统计学意义(x2=0.029,P=0.866),两种检测方法检测结果为高度一致性;以IGRA作为结核感染的参考标准,EC皮肤试验的敏感度为85.71％(18/21)、特异度为98.32％(117/119)、阳性预测值为90.00％(18/20)、阴性预测值为97.50％(117/120);男性EC阳性率(32.73％,18/55)明显高于女性(2.35％,2/85),差异有统计学意义(x2=17.983,P＜0.001).结论:EC皮肤试验具有较强的特异性,可用于肺结核密切接触者结核分枝杆菌感染筛查,但受限于使用年龄和接种禁忌证,可采用IGRA对无法进行EC皮肤试验者进行补充检测.

目的 了解江苏省扬州市入学新生基于重组结核杆菌融合蛋白(EC)皮肤试验筛查出的结核分枝杆菌(MTB)感染和肺结核发病情况及影响因素,为完善扬州市学校结核病防控策略提供数据支撑和科学依据.方法 对扬州市2023年秋季寄宿制初中、高中/职高及高校新生开展EC皮肤试验筛查,对EC皮肤试验阳性者再行胸部电子计算机断层扫描检查.分析比较新生中EC皮肤试验阳性与肺结核患者检出情况.结果 EC皮肤试验筛查17 093名新生,阳性173例(1.01％),发现肺结核患者18例(10.53/万).多因素logistics回归分析显示中部地区[比值比(OR)=2.31,95％置信区间(CI):1.22～4.37]和西部地区(OR=5.99,95％CI:3.07～11.68)新生感染MTB风险高于东部地区;西部地区新生(OR=18.31,95％CI:2.43～138.05)检出肺结核的风险高于东部地区;结核病既往史(OR=7.47,95％CI:1.43～39.00)和结核病接触史(OR=6.79,95％CI:2.13～21.72)是新生感染MTB的危险因素;有结核病既往史(OR=31.77,95％CI:3.50～288.60)和有结核病接触史(OR=13.62,95％CI:1.63～113.66)的新生检出肺结核的风险也越高.结论 应用EC皮肤试验开展结核病筛查是发现扬州市入学新生中结核病传染源的重要途径,针对MTB感染者和肺结核患者采取相应的防治措施,能够有效降低学校结核病疫情的发生风险,应推广至全市范围.来自中、西部地区、有结核病既往史及结核病接触史的新生是结核病筛查的重点人群.

目的 评价重组结核杆菌融合蛋白皮肤试验(EC-ST)筛查艾滋病病毒感染者和艾滋病患者(HIV/AIDS)结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)的效果,为EC-ST筛查HIV/AIDS病例LTBI的适用性提供依据.方法 于2023年4-6月,选择江苏省扬州市在管在治的HIV/AIDS病例为研究对象,通过问卷调查收集基本资料,分别采用EC-ST和γ-干扰素释放试验(IGRA)筛查LTBI.以IGRA结果为诊断标准,分析EC-ST筛查阳性率、灵敏度、特异度和一致率,以及CD4+T淋巴细胞(CD4)计数对EC-ST筛查效果的影响.结果 纳入HIV/AIDS病例523例,其中男性458例,占87.57%;女性65例,占12.43%;年龄M(QR)为48.00(21.00)岁.EC-ST阳性率为7.27%,IGRA阳性率为7.46%,差异无统计学意义(P>0.05).两种方法的一致率为94.84%,Kappa值为0.621(95%CI:0.489～0.752,P＜0.05);EC-ST的灵敏度为64.10%,特异度为97.31%.CD4计数<500和≥500个/μL组比较,两种方法的一致率分别为95.32%和94.44%,Kappa值分别为0.568和0.650(均P＜0.05),EC-ST阳性率、灵敏度和特异度差异无统计学意义(均P>0.05);CD4计数<200和≥200个/μL组比较,两种方法的一致率分别为96.55%和94.62%,Kappa值分别为0.648和0.619(均P＜0.05),EC-ST阳性率、灵敏度和特异度差异无统计学意义(均P>0.05).结论 EC-ST筛查HIV/AIDS病例LTBI的效果与IGRA存在一致性,且不受CD4计数水平的影响.

2023年11月,金华市疾病预防控制中心接到报告,发现金华市某公司3例肺结核病例,立即组织人员对病例及其密切接触者开展现场流行病学调查.本起疫情共发现3例肺结核病例,罹患率为9.68%.首例病例咳嗽咳痰1年余,于2023年11月16日诊断为利福平耐药肺结核,另2例为其同事,分别于11月20日和21日诊断为利福平耐药肺结核和病原学阴性肺结核.根据流行病学调查和实验室检测结果,判断这是一起利福平耐药肺结核聚集性疫情.首例病例未及时就医,通过接触传播导致其他同事感染可能是疫情发生的主要原因.密切接触者筛查发现结核分枝杆菌纯蛋白衍生物皮肤试验阳性或重组结核杆菌融合蛋白皮肤试验阳性8人,给予预防性微卡注射治疗,3个月后随访未发现新发肺结核病例.本起疫情提示该公司应加强肺结核防治健康教育,开展日常性健康监测,完善员工体检制度,提高肺结核发现敏感性.

目的 建立重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,“EC”为重组融合蛋白“结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)”;简称“EC”]原液及成品的质量标准.方法 选取6批次EC原液及11批次EC成品、体质量300～400 g无特定病原体(SPF)级白色豚鼠21只、卡介苗(BCG)活菌菌液(1 mg/ml)、结核分枝杆菌减毒株H37Ra活菌菌液(2 mg/ml)作为实验材料,建立EC原液质量标准,包括残余抗生素活性检测、致敏效应实验、效价测定及动物法鉴别实验;建立EC成品质量标准,包括鉴别实验及效价测定;应用建立的质量检测标准对连续6批次EC原液和11批次EC成品进行检测,验证其适用性和可行性.结果 (1)EC原液残余抗生素活性检测.①专属性实验:磷酸盐缓冲液的吸光度值(A值)为1.736,卡那霉素标准品(0.0 ng/ml)的A值为2.178;②线性与范围实验:卡那霉素标准品在0.5～40.5 ng/ml范围内,连续3次实验回归方程拟合优度的判定系数R2均大于0.99;③准确性实验:连续3批次EC原液的卡那霉素残留量回收率分别为112.163％、117.285％、103.527％;④重复性实验:连续3批EC原液重复性实验A值相对标准偏差(RSD)分别为5.59％、9.18％、8.07％;⑤中间精密度实验:同一实验员不同时间及不同实验员检测连续3批次EC原液卡那霉素残留量检测均小于定量限0.5 ng/ml,为限量测定;⑥耐用性实验:改变读板时间(0、5、10 min)对EC原液卡那霉素残留量检测无影响,卡那霉素残留量均小于定量限0.5 ng/ml.(2)EC原液效价测定:稀释度为1 μg/ml(5 U/ml)、2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)及10 μg/ml(50 U/ml)时,每个稀释度对应的2批次EC原液动物皮肤试验的硬结或红晕平均直径及硬结或红晕平均直径总和比值分别为(15.17±0.88) mm、(13.67±1.25) mm、1.11 (91.00/82.00);(17.00±1.76) mm、(16.08±1.32) mm、1.06(102.00/96.50);(19.58±1.69) mm、(17.67±1.37)mm、1.11(117.50/106.00);(20.75±1.57) mm、(20.25±1.17) mm、1.02(124.50/121.50).(3)EC原液动物法鉴别实验;连续3批次EC原液动物皮肤试验的硬结或红晕平均直径均为0,TB-PPD动物皮肤试验的硬结平均直径为(15.13±5.06) mm.(4)EC成品鉴别试验:连续3个批次EC成品动物皮肤试验的硬结或红晕平均直径均为0,TB-PPD动物皮肤试验的硬结平均直径为(16.50±2.65) mm.(5)质量标准验证:①EC原液:残余抗生素活性检测结果均低于定量限0.5 ng/ml;致敏效应实验结果均为皮肤试验后豚鼠注射部位局部反应无明显区别,也无全身反应;每个稀释度[2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5μg/ml(25 U/ml)及10 μg/ml (50U/ml)]在皮内注射后24h所产生的局部硬结或红晕反应平均直径均≥8mm,与相应稀释度参考品的局部硬结或红晕平均直径总和的比值为0.9±0.1;动物法鉴别实验结果为EC原液对BCG活菌致敏组豚鼠的皮肤试验结果均呈阴性反应(硬结或红晕平均直径＜5 mm),而TB-PPD呈阳性反应(硬结平均直径≥5 mm).②EC成品检测:各批次成品对BCG活菌致敏组豚鼠的皮肤试验均呈阴性反应(硬结或红晕平均直径＜5 mm),而TB-PPD呈阳性反应(硬结平均直径≥5mm).结论 所建立的质量标准可用于EC原液及成品的检定.

目的 考察重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,“EC”为重组融合蛋白“结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)”](以下简称“EC”)原液的储存稳定性、成品储存及使用的稳定性与有效性.方法 (1)原液储存稳定性研究:将3批次EC原液储存于-70℃,观察0～36个月,保存0、3、6、9、12、18、24、36个月时取样进行致敏效应试验、鉴别试验、效价检测,以及等电点、分子量、蛋白质含量、纯度(电泳法)等检测,其中致敏效应试验用豚鼠分为试验组(注射EC原液)与对照组(注射稳定剂),观察注射后动物反应,两组动物反应应无差异;鉴别试验为卡介苗致敏后豚鼠分别皮内注射EC原液和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD),观察测量豚鼠皮肤试验检测结果,EC原液皮肤试验应呈阴性反应(硬结或红晕平均直径＜5 mm),而TB-PPD皮肤试验应呈阳性反应(硬结平均直径≥5 mm);效价检测为结核分枝杆菌活菌致敏后6只豚鼠分别皮内注射3个稀释度的EC原液及参考品,观察测量豚鼠皮肤试验检测结果,不同稀释度的EC原液与参考品皮肤试验局部反应的硬结或红晕平均直径总和的比值(以下简称“平均直径总和比值”)应为1.0±0.2;等电点应为3.5～5.3,分子量应为(23±2.0)kDa(1 kDa的相对分子质量为1000),蛋白质含量应不低于450.0 μg/ml,纯度(电泳法)应不低于95.0％.(2)EC成品储存稳定性研究:成品分别储存于37℃和2～8℃,分别观察0～28 d和0～36个月,37℃保存0、7、14、21、28 d时、2～8℃保存0、3、6、9、12、18、24、36个月时取样进行鉴别试验、效价检测,以及pH值、苯酚含量等检测,其中鉴别试验方法及检测结果判定如“EC原液”.效价检测为结核分枝杆菌活菌致敏后4只豚鼠分别皮内注射EC成品及参考品,观察测量方法及平均直径总和比值判定如“EC原液”,pH值应为6.8～7.4,苯酚含量应不高于3.0 g/L.(3)EC成品使用稳定性研究:成品开启后分别放置于温度(25±2)℃、湿度(60±5)％和温度(40±2)℃、湿度(75±5)％两种条件考察使用过程的稳定性,观察时间为0～50 min,分别于0、10、20、30、40、50 min取样进行鉴别试验、效价检测,以及pH值、渗透压摩尔浓度等检测,试验方法和检测结果判定如“EC成品”,其中渗透压摩尔浓度应为(280.0±68.0)mOsmol/kg.依据定期取样检测结果是否符合EC质量标准来判断产品稳定性,并为制定EC原液、成品有效期和成品使用时的有效时间提供依据.结果 (1)EC原液-70℃观察0～36个月,在各研究时间点,致敏效应试验均表现为试验组与对照组动物反应无差异;鉴别试验结果为EC原液皮肤试验呈阴性,而TB-PPD皮肤试验呈阳性;效价检测结果为不同稀释度的EC原液与参考品皮肤试验的平均直径总和比值为0.9～1.1;等电点为3.7～5.2;分子量为(23.2～24.2) kDa;蛋白质含量为(501.6～616.7) μg/ml,纯度(电泳法)均为100.0％.(2)EC成品稳定性研究:在各研究时间点,鉴别试验结果为EC成品皮肤试验呈阴性,而TB-PPD皮肤试验呈阳性;效价检测结果显示EC成品与参考品皮肤试验的平均直径总和比值为0.9～1.0;pH值为7.1～7.4、苯酚含量为(2.6～2.9) g/L.(3)EC成品使用稳定性研究结果:在各研究时间点,鉴别试验结果均为EC成品皮肤试验呈阴性,而TB-PPD皮肤试验呈阳性;效价检测结果显示EC成品与参考品皮肤试验的平均直径总和比值均为1.0;pH值为7.1～7.2;渗透压摩尔浓度为(302.4～307.4)mOsmol/kg.结论 EC原液-70℃储存36个月质量稳定;成品37℃储存28 d、2～8℃储存36个月质量稳定;成品在开启后50min内使用,质量稳定.

目的 以冻干重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,“EC”为重组融合蛋白“结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)”](以下简称“EC”)原液为原材料,研制EC变态反应原原液效力评价用国家参考品.方法 以电泳法、高效液相色谱法分别测定备选EC原液纯度,纯度合格后经精密称量、分装、冻干制成候选国家参考品,再测定其蛋白质和水分含量.将候选国家参考品稀释成不同稀释度后,皮内注射结核分枝杆菌活菌致敏的豚鼠,根据皮肤试验硬结或红晕反应平均直径大小(简称“反应平均直径大小”)结果探索原液效价测定的适宜稀释度.在此基础上,将候选国家参考品用于EC原液的效价测定并进行方法验证,初步评价其适用性能.研究还初步观察了候选品在-20℃放置24个月的稳定性.结果 EC原液电泳法纯度为100.00％,高效液相色谱法纯度为95.33％,候选国家参考品蛋白质含量为508 μg/瓶,水分含量为1.57％,分装精度控制在±1％以内.稀释度探索结果显示:候选品稀释度为2.5 μg/ml(12.5U/ml)、5μμg/ml(25 U/ml)和10 μg/ml(50 U/ml)时剂量对数反应平均直径大小曲线有良好的线性关系(R2=0.9944),可作为后续研究的适宜稀释度.将候选国家参考品用于EC原液效价测定,两者剂量对数反应平均直径大小曲线趋势基本一致(R2=0.9878,R2=0.9643),且每个稀释度EC原液与相应稀释度候选国家参考品反应平均直径大小的比值均满足1.0±0.2.方法 验证结果显示:候选国家参考品和EC原液的剂量对数反应平均直径大小曲线趋势基本一致(R2=0.9999,R2=0.9815),且两者相应稀释度反应平均直径大小的比值均满足1.0±0.2,方法可行.初步稳定性研究结果显示:-20℃放置24个月的候选国家参考品效价测定性能稳定.结论 候选国家参考品的纯度、蛋白质含量、水分含量及均匀性检测均符合国家参考品质量要求,将其稀释到适宜稀释度后可用于EC原液的效价测定;经方法验证与稳定性观察,显示其性能良好,为国家参考品申报提供了基础.

中国是结核病高负担国家之一,结核病发病例数与潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)人数庞大,给我国结核病防控工作带来了巨大的挑战.有效识别结核病和LTBI对控制结核病疫情有重要意义.菌阴肺结核和LTBI的诊断依赖于结核感染的免疫学诊断方法;现行结核感染免疫学检测方法主要是结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST)、γ干扰素释放试验(interferon gamma release assays,IGRA)和抗原抗体检测.在现行的三类方法基础上,研发出了敏感度高、特异度强、试验操作简单、可用于LTBI和结核病诊断的新产品和新技术——重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,“EC”为重组融合蛋白“结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)”](简称“EC”).目前,已完成EC的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期临床试验.其中Ⅲ期临床试验中对1559名健康人群的筛查中发现,EC与IGRA的检测结果具有较高的特异度,且两者之间具有较高的一致性(88.77％);对791例临床诊断为结核病患者的临床研究发现,EC、结核感染T淋巴细胞斑点试验(T-SPOT.TB)、结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)检测均具有良好的敏感度,且三者之间具有较高的一致性;对479名未感染结核分枝杆菌人员的研究发现,EC与T-SPOT.TB的两次检测阴性一致率较高(88.20％和93.17％);在卡介苗接种对检测结果影响的研究中发现,EC和T-SPOT.TB基本不受卡介苗的影响;对394例临床诊断非结核性疾病患者的临床研究发现,EC与T-SPOT.TB阴性符合率较高,且一致性较好(87.21％).基于EC在用于诊断结核感染安全且有效的基础上,EC通过了国家药品监督管理局药品审批而准予上市.经广泛征求有关结核病防控、临床和研究等领域的专家意见,在系统总结相关技术和方法的应用特点的基础上,结合EC的临床试验结果,形成了EC临床应用的专家共识.本共识介绍了EC的临床应用建议,包括使用对象、使用方法、结果判读,以及临床意义和使用范围.

目的 通过对重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,“EC”为重组融合蛋白“结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)”](简称“EC”)的免疫特性和临床前安全性研究,探讨其临床应用前景.方法 (1)免疫特性研究:取6只雌性豚鼠,使用结核分枝杆菌H37Ra活菌菌液致敏,5周后,皮内注射2.5 μg/ml EC原液0.2ml;取4只雌性豚鼠,使用卡介菌活菌菌液致敏,5周后,皮内注射20 μg/ml EC原液0.2ml;观察注射部位平均硬结或红晕反应直径[(纵径+横径)/2],≥5mm判为阳性,＜5 mm判为阴性.(2)急性毒性试验:取80只ICR[(美国)Institute of Cancer Research]小鼠,分为单次肌内和皮内注射组,每组40只,雌雄各半;每组再分为4组,每组10只,雌雄各半.高剂量组(注射EC53.61 μg/0.1 ml)、低剂量组(注射EC 0.2 μg/0.1 ml)、溶剂对照组(注射EC稀释液0.1 ml)、空白对照组(不给予任何受试物),观察小鼠的外观、运动功能、体质量、各脏器和药物注射部位皮肤等是否有异常.(3)豚鼠全身主动过敏试验:取豚鼠24只,分为4组,每组6只,雌雄各半,各组豚鼠分别隔日腹腔注射高剂量(5μg/kg) EC、低剂量(0.5μg/kg) EC、牛血清白蛋白(60 mg)和0.9％ NaCl(质量分数为0.9％的NaCl溶液)注射液(2 ml),连续3次.致敏结束,末次致敏后第12天静脉快速注射2倍致敏剂量对以上相应的各组致敏豚鼠进行激发.致敏期间,每天观察豚鼠的症状,并于初次和最后一次致敏及激发当日测定每只豚鼠的体质量.(4)皮内刺激试验:取6只新西兰兔,单次皮内注射EC 10 μg(0.2 ml)/点,每侧5个点,观察皮内注射后的刺激反应情况.结果 (1)免疫特性研究结果:EC原液对卡介菌活菌菌液致敏的4只豚鼠的皮肤试验,阳性为0只;EC原液对结核分枝杆菌H37Ra活菌菌液致敏的6只豚鼠的皮肤试验,阳性为6只.(2)急性毒性试验结果:所有小鼠未出现明显的急性中毒反应和显示急性中毒靶器官.小鼠皮内注射EC前、注射EC后1d、3d、5d、7d、8d、10d、12d、14d高剂量组、低剂量组小鼠平均体质量分别为(20.6±1.3) g～(24.9±2.1)g、(20.5±1.6)g～(26.0±3.1)g;注射后不同观察时间各组平均体质量与空白对照组[(21.0±1.1) g～(25.3±2.3)g]比较差异均无统计学意义(t值分别为0.571～0.392,0.695～0.615;P值分别为0.575～0.700,0.496～0.546);小鼠肌内注射EC前、注射EC后1d、3d、5d、7d、8d、10d、12d、14d高剂量组、低剂量组小鼠平均体质量分别为(21.0±1.5) g～(26.2±1.9)g、(20.5±2.1)g～(25.8±3.8)g;注射后不同观察时间各组平均体质量与空白对照组[(21.2±1.7) g～(25.8±3.1)g]比较差异均无统计学意义(t值分别为0.360～0.318,0.900～0.006;P值分别为0.723～0.754,0.380～0.995).(3)豚鼠全身主动过敏试验结果:豚鼠无过敏反应.高剂量组、低剂量组豚鼠首次致敏、末次致敏、激发的平均体质量分别为(327.5±24.3)g、(347.2±32.7)g、(402.2±34.9) g;(331.3±26.7)g、(346.2±32.0)g、(411.3±38.9)g,与相应观察时间注射0.9％NaCl的阴性对照组[(329.5±27.4)g、(348.3±27.0)g、(399.4±25.4)g]比较,差异均无统计学意义(t值分别为0.328、0.181、0.284,0.474、0.366、0.875;P值分别为0.757、0.864、0.788,0.656、0.730、0.422).(4)兔皮内刺激试验结果:单次皮内注射10 μg(0.2ml)/点EC,无明显刺激反应.结论 EC能够鉴别结核感染与卡介苗免疫,临床前动物试验安全性好,有望应用于人群结核感染的诊断与鉴别诊断.

潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)是一种对结核分枝杆菌抗原刺激产生持续免疫反应的状态,因其有进展为活动性结核病的风险,在世界范围内越来越受到重视.LTBI的筛查和预防性治疗是结核病综合防控工作的重要组成部分,但目前尚无LTBI的直接诊断方法和统一的治疗方案.除结核菌素皮肤试验和γ-干扰素释放试验两种常规检测方法外,我国新研发的重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,"EC"为重组融合蛋白"结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)"]也可用于检测LTBI.异烟肼单药预防性治疗是目前应用最为广泛的方案,但含利福霉素的治疗方案因疗程较短,依从性较高,优势更明显.现阶段我国在LTBI领域的研究相对较少,预防性治疗覆盖率低,应积极开展LTBI相关研究,探索符合国情的预防性治疗方案.