目的 制备不同浓度的兔软骨脱落细胞支架,并评估其理化性能和干细胞的相容性,为软骨修复提供实验依据.方法 Percoll密度分离法培养骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并进行流式细胞学鉴定和成骨、成软骨分化能力检测.从兔膝、股关节中切取软骨片,进行物理粉碎、反复冻融以及各种酶混合消化脱细胞.为比较并观察不同浓度脱细胞支架的理化性能差异,设计3组支架,浓度分别为100％(A组)、50％(B组)、30％(C组),每组3只.将第3代PKH26示踪的BMSCs接种于最适浓度支架上培养1周,观察细胞生长情况.结果 流式技术检测BMSCs表面抗原,CD44、CD90呈阳性表达,CD45阴性表达;成骨诱导茜素红染色可见红色钙结节;软骨诱导阿利新蓝染色见软骨结节呈蓝色;3组支架经苏木素-伊红(HE)、甲苯胺蓝染色后未观察到明显细胞形态.样本脱细胞后的DNA浓度与未脱支架的指标均值差异具有显著性(P＜0.05).糖胺聚糖含量较正常值稍偏低.3组支架两两比较孔径、吸水膨胀率、孔隙率、支架断裂强度、杨氏模量差异具有显著性(P＜0.05);干细胞与支架共培养后细胞附着良好.结论 Percoll密度分离法可获取高纯度的兔BMSCs;应用混合脱细胞方法脱细胞较彻底.B组支架可作为构建组织工程软骨修复的最适方案.体外培养的BMSCs在B组支架生长良好.

明确设施大棚土壤微量元素累积特点及污染风险是进行设施农业土壤风险管控的重要前提.本研究通过测定山东典型设施土壤中铁(Fe)、锰(Mn)、锌(Zn)、铜(Cu)、镉(Cd)、铅(Pb)、铬(Cr)总量和各形态含量,采用地积累指数法(Igeo)、风险编码法(RAC)和潜在生态危害指数法(PERI)评价土壤微量元素的污染特征,结合正定矩阵因子分解(PMF)模型和健康风险评估模型鉴定微量元素的潜在来源并计算其风险水平.结果表明:研究区域土壤Fe、Mn、Zn、Cu、Cd、Cr全量均呈累积趋势,Cd含量最大值超出土壤污染风险管制值.随种植年限增加,Mn、Zn、Cd和Cr元素有效态含量均呈增加趋势;PMF模型确定研究区域土壤主要受农业源、工业源的影响,贡献率分别为31.49％和24.07％;Igeo、RAC和PERI评价结果显示,土壤Cd、Pb、Cu、Zn全量均有超标,Pb和Zn有效态含量超标,Cd元素单项生态危害指数(Ei)高,综合潜在生态危害指数(RI)均无风险.研究区土壤中微量元素对成人构成非致癌风险和致癌风险的概率分别为36.78％和0.03％,Cr元素是非致癌和致癌风险优先控制元素.

目的:探究慢性应激对动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)小鼠心肌损伤的影响并揭示其潜在机制.方法:选用SPF级8周龄雄性C57BL/6J小鼠和ApoE-/-小鼠.10周饮食干预后进行AS病理观察,AS鉴定成模后再复合慢性不可预计温和刺激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)6周,分为五组:对照(control)组、CUMS组、AS-普通饲料喂养(AS-regular diet,AS-r)+CUMS组、AS-高脂饲料喂养(AS-high-fat diet,AS-h)组和AS-h+CUMS组,每组各10只.CUMS期间对各组小鼠进行旷场实验、糖水偏好实验;采用全自动生化分析仪检测小鼠血脂;HE、油红O染色评估主动脉根部病理改变;超声心动图评估小鼠心功能;ELISA法检测小鼠血清心肌损伤标志物含量、心肌组织ATP含量;透射电镜观察心肌线粒体超微结构;Oxygraph-2k高分辨呼吸能量代谢仪检测心肌线粒体耗氧率;Western blot检测B细胞淋巴瘤蛋白2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)和cleaved caspase-3蛋白表达.结果:与control组相比各CUMS组运动总路程、进入中央区次数、糖水偏好率均显著下降(P<0.05);各AS组主动脉根部均出现了不同程度的脂质沉积及内皮损伤,心功能均显著下降(P<0.05)、并伴随不同程度心肌损伤(P<0.05);AS-h+CUMS、AS-r+CUMS心肌线粒体结构破坏,ATP含量显著下降(P<0.05),线粒体呼吸链复合物I支持的呼吸、线粒体呼吸链复合物I+II支持的呼吸和电子传递系统最大呼吸能力均显著下降(P<0.05);Bax和cleaved caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05).结论:慢性应激通过破坏AS小鼠心肌线粒体结构及能量代谢功能导致线粒体非稳态负荷发生,进而加剧心肌细胞凋亡加重心肌损伤.

目的 建立栀子中萜类物质的高通量分析方法,并将其应用于栀子与水栀子的成分差异研究.方法 结合液相色谱-三重四级杆质谱仪中的全扫描、子离子扫描、母离子监测、中性丢失离子扫描、多反应离子监测、动态多反应离子监测等多种技术提出栀子中萜类物质的定性、定量分析策略,进一步应用主成分分析和正交偏最小二乘判别分析等多元变量分析方法研究栀子与水栀子的成分差异.结果 共鉴定出并相对定量81种萜类物质,发现栀子与水栀子间萜类物质含量差异显著,其中13种物质可作为鉴别栀子与水栀子的差异标志物.结论 所建立的方法操作便捷,结果准确,为栀子药材鉴别及质量评价提供了新思路,并为栀子资源的合理开发利用提供了参考依据.

目的 构建表达新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Omicron BA.1变异株S1蛋白的真核表达载体,在CHO-K1细胞中进行表达,评价其免疫原性,并对佐剂和抗原剂量进行研究.方法 构建重组质粒UCOE-Omi-S1,转染至CHO-K1工程细胞中进行表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blot法实验鉴定重组S1蛋白.将BALB/c小鼠随机分为12组,即 PBS组,无佐剂组(高、中、低剂量组),铝盐佐剂对照组,MF59佐剂对照组,铝盐佐剂实验组(高、中、低剂量组),MF59佐剂实验组(高、中、低剂量组),将按照分组要求配比的溶液经小鼠肌内注射3次,间隔14天,每2周尾静脉采血,末次免疫30天后取血分离血清,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清抗体水平,并和SARS-CoV-2原型株的假病毒和SARS-CoV-2 Omicron BA.1变异株的假病毒进行假病毒中和实验.结果 目的蛋白在CHO-K1工程细胞表达后可分泌到培养上清中,在相对分子质量约为70kDa处可见1条特异性蛋白表达条带,经Western blot法鉴定为Omi-S1蛋白.铝盐佐剂组和MF59佐剂组免疫诱导效果优于无佐剂组,铝盐佐剂组和MF59佐剂组免疫诱导效果相差不大,但MF59佐剂起效快;高、中、低剂量组的免疫诱导效果在第8周相差不大,但高剂量组起效快.假病毒中和实验表明,MF59佐剂实验组针对Omicron变异株的中和抗体水平高于铝盐佐剂组.结论 本研究所构建的Omicron S1重组蛋白免疫原性良好,在小鼠体内产生了良好的体液免疫应答,并诱导高水平的对抗SARS-CoV-2假病毒的中和抗体,对佐剂和抗原剂量初步研究,结果显示,10μg以下抗原剂量搭配MF59佐剂可获得较好的免疫效果.本研究为SARS-CoV-2变异株的重组蛋白疫苗的研制提供了实验基础.

目的:了解成人大骨节病患者肢体功能障碍程度，以及大骨节病临床分度与肢体残疾分级的相关性。方法:根据监测数据采用典型调查方法，2015年在黑龙江省大骨节病历史重病区选取10个自然村为调查点。以年龄≥40岁的大骨节病患者作为调查对象，进行问卷调查、关节活动度（ROM）测量以及X线片拍摄。依据《残疾人残疾分类和分级》（GB/T 26341-2010）国家标准对调查对象肢体残疾程度予以评价，并对大骨节病临床分度与肢体残疾分级进行相关分析。结果:共调查137例成人大骨节病患者，年龄为（57.4 ± 9.9）岁；其中男性84例，女性53例；Ⅰ度95例，Ⅱ度30例，Ⅲ度12例。患者关节疼痛上肢以指间关节最为多见（126例，126/137），其次是肘关节（116例，116/137）；下肢则以踝关节（118例，118/137）、膝关节为主（107例，107/137）。肘关节伸、膝关节屈和伸、踝关节背屈和跖屈、髋关节和腕关节掌伸活动的功能障碍检出率在各年龄组间比较差异有统计学意义（ P均< 0.05），随患者年龄增长而升高。大骨节病临床分度与肢体残疾分级不相关（ rs = - 0.142， P > 0.05）。大骨节病患者以三级肢体残疾所占比例最高（60例，60/137）。男性较女性患者肢体残疾严重（χ 2 = 22.610， P < 0.01）。 结论:成人大骨节病患者关节疼痛上肢以指间关节疼痛最为多见，下肢以踝关节、膝关节为主。临床分度与肢体残疾分级水平间未见关联性，男性患者肢体残疾程度较女性患者重。

目的:建立H5N1假病毒的体内感染模型，并对抗体FHA3的体内中和活性进行鉴定。方法:依据A/Anhui/1/2005/H5N1毒株血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的序列信息，构建重组表达质粒pcDNA3.1-HA5和pcDNA3.1-NA1，并与质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染293T细胞制备H5N1假病毒上清，电镜观察上清中假病毒颗粒形态。假病毒上清感染MDCK细胞后，测定病毒滴度；经腹腔注射入BALB/c小鼠体内，在感染后2、5、8、12 d进行生物发光成像，检测假病毒体内感染情况。利用建立的小鼠感染模型，评价抗体FHA3的体内功能活性。结果:重组表达质粒pcDNA3.1-HA5和pcDNA3.1-NA1构建正确，与pNL4-3.Luc.R-E-质粒共转染293T细胞可制备出高滴度的假病毒上清，电镜下可见圆形的病毒颗粒。H5N1假病毒感染后，小鼠体内发出较强的荧光，而攻毒前给予抗体FHA3处理可减弱其荧光信号。结论:成功构建出H5N1假病毒体内感染模型，并证实抗体FHA3对假病毒的感染具有体内保护作用。

目的:构建表达结核分枝杆菌( Mycobacterium tuberculosis， Mtb)潜伏期表达抗原Rv3133c，通过人群以及小鼠实验评价其免疫原性。 方法:构建重组质粒pPROEX-Rv3133c，诱导表达并纯化蛋白质，经Western blot鉴定后，用全血干扰素释放试验评价重组蛋白rRv3133c在 Mtb感染人群中的免疫原性；联合佐剂DC免疫小鼠，检测小鼠血清中rRv3133c特异性抗体分泌水平、脾细胞中抗原特异性Th1型细胞因子分泌水平以及脾细胞中多功能T细胞免疫应答水平和肺脏组织细胞因子mRNA表达水平。 结果:成功构建表达rRv3133c。rRv3133c可刺激 Mtb感染者尤其是潜伏感染者产生高水平的IFN-γ。免疫小鼠后，rRv3133c+DC组小鼠脾脏IFN-γ、TNF-α、IL-2水平，以及IFN-γ +TNF-α +CD4 +T细胞数量和肺脏组织中抗原特异性IFN-γ、TNF-α、iNOS的mRNA表达水平均高于BCG组，但低于BCG+rRv3133c+DC组；rRv3133c+DC组和BCG+rRv3133c+DC组小鼠血清中IgG2a/IgG1比值均大于1，显著高于BCG组。 结论:rRv3133c具有良好的免疫原性，可以诱发机体产生较强的Th1型免疫应答，是结核病亚单位疫苗的潜在候选靶抗原。

目的:掌握克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）核蛋白（NP）和糖蛋白（GP）片段的精细抗原表位谱分布，明确优势抗原表位在克里米亚-刚果出血热（CCHF）实验室检测中的价值。方法:2014—2021年在新疆大学生命科学院实验室将CCHFV YL04057株采用改良生物肽合成方法分段表达出由8个氨基酸组成的最小合成短肽，以CCHFV多克隆抗体或单克隆抗体14B7（IgM）或CCHFV阳性羊血清为抗体，用免疫印迹方法鉴定出NP和GP片段上具有抗原活性的最小抗原表位（BCE），并采用邻接法将获得的具有序列多态性的BCE与不同地区的CCHFV进行空间聚类，确定BCE组合方式与地理区域分布的相关性，探讨其在建立血清学诊断中的应用价值。采用原核表达质粒（pET-32a、pGEX-KG）和带有不完整谷胱甘肽（GST188）标签的原核表达质粒（pXXGST-ST-1）构建和表达NP片段上6个不同肽段长度的优势抗原表位，建立间接酶联免疫吸附测定（ELISA）检测方法，以经免疫荧光法（IFA）鉴定的CCHF羊血清为对照，统计分析不同肽段长度的抗原表位重组蛋白与IFA检测结果的特异度、敏感度和总符合率。结果:CCHFV NP和GP片段共有30个具有抗原活性的BCE，其中NP片段抗原表位集中的核心中间片段NP 2（aa 170~305）有6个BCE，两端的NP 1（aa 1~200）和NP 3（aa 286~482）有9个BCE；GP片段的Gc（aa 1~558）和Gn（aa 533~708）片段有14个BCE和1个包含15个氨基酸的长抗原肽（AP），NP片段BCE氨基酸序列的同源性为97.1%，GP片段对应的同源性为89.1%。在GP片段9个具有序列多态性的BCE中，由GnEc1、GnE2、GnE4、GcE3、GcE6和GcAP-4（Ap）6个组合BCE可将15株来自全球不同地区的CCHFV聚类成亚洲Ⅰ、亚洲Ⅱ、非洲Ⅰ、非洲Ⅱ和欧洲 5个地理类群。构建表达的PET-32a-NP（全长）、PGEX-KG-NP 2（aa 170~305）、pGEX-KG-NP 2-1（aa 235~275）、PGEX-KG-NP 2-1-1（aa 237~256）、pXXGST-1-NP 2-1-2（aa 250~265）和PGEX-KG-NP 2-1-3（aa 260~276）6个重组蛋白CCHFV NP兔多克隆抗血清（pAb）免疫印迹反应阳性，以33份经IFA CCHF检测的羊血清为参照，以NP 2和NP 2-1 2个片段构建的重组蛋白为抗原建立的间接ELISA检测方法检测敏感度、特异度和总符合率最好，敏感度分别为73.4%（11/15）和66.7%（10/15），特异度分别为100%（18/18）和94.4%（17/18），总符合率分别为87.9%（29/33）和81.8%（27/33）。 结论:CCHFV NP和GP上分布着数量较多的具有抗原免疫活性的BCE，其中，优势抗原表位在CCHF实验室血清学诊断中具有较高的应用价值。

目的:开发用于甲型流感病毒快速分型的Taqman低密度芯片(Taqman low density array，TLDA)，可以同时开展甲型流感病毒通用、H1-H16及N1-N9亚型高通量快速鉴定，适用于流感样病例及禽流感标本中甲型流感病毒的快速分型鉴定。方法:设计甲型流感病毒通用、H1-16亚型、N1-9亚型的引物探针，并将其预先定制在TLDA反应芯片上；优化TLDA退火温度；用多种亚型的甲型流感病毒核酸进行10倍梯度稀释，结合微滴式数字PCR定量方法评价TLDA检测灵敏度；用乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞等其他多种常见的呼吸道病毒验证该TLDA检测特异性，同时选用多种已经明确分型的甲型流感病毒评价该TLDA的特异性和有效性；采集16例流感样病例标本及24例禽流感外环境标本用该芯片开展检测。结果:该TLDA的最佳退火温度为60 ℃；针对甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N6、H7N9和H9N2，其检测灵敏度为1.52~8.00拷贝/μl；能特异性检测甲型流感病毒，与其他常见呼吸道病毒无交叉反应，并能精准鉴定多种甲型流感病毒的亚型；应用该方法检测16例流感样病例标本和24例禽流感外环境监测标本，均可分型。结论:基于TLDA技术建立的甲型流感病毒高通量快速分型检测方法具有较好的灵敏度和特异性，适用于流感样病例和禽流感标本的病原快速检测，特别是对目前用常规商业化试剂尚无法鉴定的新型甲型流感病毒能够进行快速的亚型筛查与鉴定。