2008年，TMEM16A被确定为是钙离子激活氯离子通道蛋白家族成员，同时证明该通道可以被胞内钙浓度增加激活 [1,2,3]，截至目前发现除胞内钙浓度之外，膜电压 [4,5]、钙调蛋白 [6,7]、氢离子 [8]、磷脂酰肌醇 [9,10]、热效应 [11]和机械效应 [12]等激活。该通道广泛表达于多种细胞，包括上皮细胞 [13,14,15]、血管平滑肌细胞 [16]、血管内皮细胞 [17]、心房细胞 [18]、胰腺腺泡细胞 [19]和感觉神经元 [11]等，定位于细胞膜表面 [20,21]。自2008年被发现以来，亲水性分析预测TMEM16A有8个跨膜结构域 [1,2,3]，后2014年晶体结构分析证实该分子有10个跨膜结构域，膜的疏水核心中嵌入了一个高度保守的区域，包含一个Ca 2+结合位点，介导TMEM16A的Ca 2+激活 [22]（图1）。

钙激活氯离子通道(CaCC)是一类能通过胞内钙离子激活转运氯离子的通道蛋白,其主要在神经元和肌细胞中参与调节膜电位、细胞内钙平衡和细胞兴奋性等重要的生理作用.Anoctamin(Ano)家族中Ano1是最经典的CaCC,Ano1的靶向调节剂对癌症、囊性纤维化、高血压、腹泻和哮喘等疾病具有潜在治疗作用.自2008年Ano1首次被发现后,先后出现了多种CaCC特异性调节剂的筛选方法,主要包括基于荧光蛋白的高通量初级筛选、电生理膜片钳技术和虚拟筛选,进而发现了多种药理学作用不同的小分子调节剂.本文综述了目前较为主流的筛选方法的原理和优缺点,并对迄今发现的Ano1特异性调节剂的化学结构和潜在的应用进展进行综述.

目的 研究枳术颗粒对功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)大鼠的药效及作用机制.方法 复合因素造模法诱导大鼠FD模型,造模成功后给予枳术颗粒治疗2周,观察枳术颗粒对FD大鼠胃残留率、小肠推进率、血清中胃泌素(gastrin,GAS)、胃饥饿素(growth hormone releasing peptide,Ghrelin)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)及生长抑素(somatostatin,SS)含量的影响;苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法观察胃窦组织、十二指肠组织病理变化;利用qRT-PCR检测下丘脑及胃组织中GAS、Ghrelin、CGRP、SSmRNA表达和胃及十二指肠组织中肾上腺素能受体 β1(β1-adrenergic receptor,ADRB1)、生长抑素受体(somatostatin receptor,SSTR)、胃饥饿素-O-乙酰转移酶(ghrelin-O-acyltransferase,GOAT)、胃饥饿素受体(growth hormone secreting hormone receptor,GHSR)、酪氨酸激酶受体(c-kit protooncogene protein,C-kit)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)、钙激活氯离子通道蛋白 Anoctamin-1(ANO1)、肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)mRNA表达;利用Western blotting检测胃及十二指肠组织中C-kit、SCF蛋白表达.结果 枳术颗粒可以显著降低FD大鼠胃残留率(P＜0.05),提高小肠推进率(P＜0.01);升高血清中Ghrelin、GAS含量(P＜0.01),降低CGRP、SS含量(P＜0.05、0.01);升高下丘脑及胃窦组织中Ghrelin、GAS mRNA表达水平(P＜0.05、0.01),降低下丘脑及胃窦组织中CGRP、SSmRNA表达水平(P＜0.01);显著升高胃及十二指肠组织SCF、C-kit蛋白表达水平(P＜0.05、0.01),升高胃及十二指肠组织 ADRB1、GOAT、GHSR、SCF、C-kit、ANO1、MLCK mRNA 表达水平(P＜0.05、0.01),降低SSTR mRNA表达水平(P＜0.05、0.01).结论 枳术颗粒可以改善FD大鼠的胃动力异常,其作用机制可能与调节脑肠肽水平、激活SCF/C-kit通路有关.

目的 通过气道类器官培养研究哮喘中肝激酶B1(Lkb1)调控上皮再生的机制.方法 取Lkb1f/f(对照组,10只)和Scgb1a1CreER;Lkb1f/f小鼠(Lkb1敲除组,9只),采用雾化吸入鸡卵清蛋白(OVA)的方法建立过敏性哮喘模型,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织,统计BALF中炎性细胞数量,肺组织切片免疫荧光染色比较钙激活氯离子通道蛋白3(CLCA3)阳性细胞数量.通过流式细胞术分选出Club细胞进行类器官培养,统计类器官的平均直径和类器官形成率,回收细胞通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测高脚杯细胞标志物CLCA3、纤毛细胞标志物叉头框蛋白J1(FOXJ1)和Club细胞中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的表达水平.结果 与对照组相比,Lkb1敲除组BALF中巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量变化差异无统计学意义;Lkb1敲除后CLCA3阳性细胞数量减少;类器官培养结果显示敲除Lkb1后Club细胞来源的类器官平均直径减小,类器官形成率降低,纤毛细胞分化标志物FOXJ1 mRNA表达水平降低,缺失Lkb1后Club细胞表达AMPKα水平降低,且Club细胞增殖受到抑制,激活Lkb1的下游信号通路AMPK可以减弱Lkb1缺失对Club细胞再生功能的影响.结论 Lkb1通过AMPK通路促进气道祖细胞增殖.

目的:探讨钙激活Cl-通道蛋白(CLCA)在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)体外气道上皮细胞中的蛋白表达情况,并初步探讨其作用.方法:运用脂多糖(LPS)刺激16HBE细胞系,Western Blot检测hCLCA1蛋白表达水平与ARDS的时程关系;运用hCLCA1-siRNA干扰16HBE细胞系中hCLCA1的表达,real-time RT-PCR法检测细胞系中hCLCA1的mRNA和蛋白表达水平,验证siRN A是否对目的基因成功抑制.同时检测炎症因子的m RN A表达变化水平,观察CLCA的降低与炎症因子表达的关系.结果:Western Blot结果显示:16HBE细胞系加LPS(1μg/ml)刺激12h、24h后hCLCA1的蛋白表达量下降,且LPS刺激24h后hCLCA1的降低有统计学差异(P<0.05).real-time RT-PCR检测证实hCLCA1-siRNA对目的基因成功抑制,表明成功构建hCLCA1低表达的16HBE细胞系;同时real-time RT-PCR结果显示TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平升高(P<0.05).结论:CLCA在LPS刺激后的培养HBE细胞系中蛋白表达水平下降,并表现为时间依赖性.抑制HBE细胞系hCLCA1的基因表达,则该细胞分泌炎症因子的水平升高,推测CLCA在ARDS体外气道上皮细胞分泌炎症介质过程中发挥负性调节作用.

目的 探讨氯离子通道蛋白1(ANO1)在心肌纤维化进程中的表达特征,为抑制心肌纤维化寻找新的靶点.方法 采用冠状动脉结扎法制作大鼠心肌梗死模型,1周后取心肌梗死组和假手术组大鼠左心室组织,采用免疫组织化学染色、免疫荧光双标记检测梗死区和正常组织ANO1表达的变化;体外分离培养心肌成纤维细胞,采用免疫荧光标记、Real-time PCR和Western blotting检测心肌成纤维细胞中ANO1表达情况.结果 制造模型1周后心肌梗死区ANO1表达明显增强,并与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)共表达;ANO1蛋白明显表达于心肌成纤维细胞的核膜和胞质中,且表达强度和α-SMA具有相同的趋势;与刚分离贴壁心肌纤维细胞相比,ANO1在培养和48h后的心肌成纤维细胞中表达量明显增强.结论 ANO1在心肌成纤维细胞转化为成肌纤维细胞过程中表达量增加,提示ANO1可能在心肌纤维化进程中发挥重要调控作用.

目的 探讨钙离子激活氯离子通道蛋白7(ANO7)在前列腺癌核因子-κB(NF-κB)信号通路的表达及其临床意义.方法 利用Tribbles同源蛋白1(TRIB1)过表达前列腺癌细胞株构建NF-κB信号通路激活细胞和动物模型,NF-κB信号通路抑制剂构建NF-κB信号通路抑制细胞模型.用蛋白质印迹法(Western blot)、实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和免疫组织化学(IHC)分析前列腺癌中NF-κB信号通路对ANO7表达的调控影响,分析临床数据中ANO7表达与前列腺癌临床病理特征之间的关系.结果 在NF-κB信号通路激活细胞和动物模型中可见ANO7表达上调;在NF-κB信号通路抑制细胞模型中可见ANO7表达下调.组织芯片中ANO7在肿瘤组织和癌旁组织中高表达率分别为45.8％、85.7％,差异有统计学意义(x2=7.258,P＜0.01).ANO7表达与Gleason评分、病理分级显著相关(x2=19.797,19.797,P＜0.01),癌症基因组图谱(TCGA)与泰勒(Taylor)数据库得到相似的结果.运用Kaplan-Meier分析发现在Taylor数据库中ANO7与患者的预后明显相关(P＜0.01).最后采用Cox回归模型进行多因素综合分析发现在影响前列腺癌预后的队列中,ANO7 (P ＜0.05)、Gleason评分(P＜0.01)和病理分级(P＜0.01)都是前列腺癌的独立预测指标.结论 NF-κB信号通路调控前列腺癌ANO7表达,且ANO7的表达与前列腺癌明显相关.

目的 构建基于钙激活氯离子通道蛋白1(ANO1)的Piezo1调节剂高通量筛选模型.方法 RT-PCR和Western印迹法分别检测Fischer大鼠甲状腺上皮(FRT)细胞Piezo1 mRNA和蛋白表达.构建共表达增强型绿色荧光蛋白标记的ANO1(ANO1-EGFP)和黄色荧光蛋白双突变体(YFP-H148Q/I152L)的FRT细胞株(简称FRT模型细胞),倒置荧光显微镜检测ANO1-EGFP和YFP-H148Q/I152L在FRT模型细胞中的表达,加入ANO1激活剂离子霉素10μmol·L-1,应用荧光淬灭动力学实验检测并计算FRT模型细胞相对荧光强度变化值.加入Piezo1调节剂Jedi1(200μmol·L-1),Jedi2(150μmol·L-1),Yoda1(20μmol·L-1)和Gd3+(20μmol·L-1),应用荧光淬灭动力学实验检测并计算FRT模型细胞相对荧光强度变化值.加入Piezo1激活剂Jedi1,Jedi2和Yoda1,按0.2,1,5,10,25,50,75,100,200,300,400,500,600,700,800,900和1000μmol·L-1设置浓度梯度,应用荧光淬灭动力学实验检测并计算FRT模型细胞相对荧光强度变化值并绘制浓度依赖曲线.向FRT细胞中加入Yoda1,按同样的方法设置浓度梯度,通过Fura-2/AM荧光探针检测细胞内的钙信号随Yoda1浓度的变化,分析细胞内Ca2+浓度与FRT模型细胞相对荧光强度变化值之间的关系.计算模型Z′因子及信噪比.结果 RT-PCR、DNA测序比对和Western印迹结果表明,FRT细胞内源性表达Piezo1.ANO1-EGFP和YFP-H148Q/I152L表达清晰,位置正确,并且ANO1-EGFP被离子霉素激活后模型荧光淬灭,证实转染基因表达的蛋白具有生物学活性,FRT模型细胞构建成功.FRT模型细胞加入Jedi1,Jedi2和Yoda1荧光均淬灭,加入Gd3+后再加入Yoda1荧光不淬灭,证实模型可以用于筛选Piezo1通道调节剂;在FRT模型细胞中离子霉素的EC50为(7.76±0.53)μmol·L-1,Yoda1的EC50为(17.27±1.21)μmol·L-1,Jedi1的EC50为(200.60±4.46)μmol·L-1,Jedi2的EC50为(158.10±4.65)μmol·L-1.FRT模型细胞相对荧光强度变化值与细胞内Ca2+浓度呈正相关,模型能敏感地反应细胞内钙信号变化.模型Z′因子为0.82,信噪比为13.29:1,可用于Piezo1通道调节剂高通量筛选.结论 成功构建了可快速、准确、便捷筛选Piezo1通道激活剂和抑制剂的高通量筛选模型.

目的:探讨干预气道杯状细胞CLCA的表达与功能,对ARDS小鼠肺脏损伤程度的影响,并通过体外细胞研究探讨其机制.方法:制备LPS诱导的ARDS小鼠模型(ARDS组),并在此模型上分别进行干预,包括气道雾化吸入CLCA非特异性阻断剂尼氟灭酸(NFA)(NFA+ARDS组)、气道滴注CLCA特异性抗体(ab-CLCA3) (ab-CLCA3+ARDS组).HE染色观察各组小鼠肺部病理及炎症特征,计算肺损伤评分.运用hCLCA1-siRNA抑制人正常支气管上皮细胞系16HBE中hCLCA1的表达,采用real-timeRT-PCR法验证抑制效果后,检测各组细胞合成多种炎症因子mRNA水平的差异.结果:HE染色显示,ARDS组与NFA+ARDS组相比,肺部病理改变及炎症细胞浸润程度无明显差异,肺损伤评分也没有统计学差异(正常组:2.0± 0.71;ARDS组:6.8± 0.45,NFA+ARDS组7.4± 0.89,P＞0.05).与ARDS组相比,ab-CLCA3+ARDS组肺部病理损伤及炎症细胞浸润程度明显加重,肺损伤评分也升高(正常组:1.8± 0.83;ARDS组:7.6± 0.55,ab-mCLCA3+ARDS组9.8± 0.83,P＜0.05).real-time RT-PCR检测证实成功构建hCLCA1低表达的16HBE细胞系,同时real-time RT-PCR结果显示TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平升高(P＜0.05).结论:阻断气道CLCA功能区域,可以加重ARDS小鼠肺部病理损伤程度及炎症细胞浸润水平,提示气道杯状细胞CLCA在ARDS小鼠肺部炎症形成过程中发挥抑制性调节作用.

目的 构建基于钙激活氯离子通道(CaCC)的瞬时受体电位香草酸亚型4(TRPV4)调节剂的高通量筛选细胞模型.方法 采用RT-PCR检测Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮(FRT)细胞中内源性表达的TRPV4,所得PCR产物切胶回收后测序;采用Western blotting检测FRT细胞中TRPV4蛋白的表达情况.应用脂质体转染法构建共表达钙激活氯离子通道蛋白1(ANO1)和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞模型,倒置荧光显微镜下观察ANO1和YFP-H148Q/I152L在细胞中的表达情况,应用荧光淬灭动力学实验测定细胞模型的有效性.加入TRPV4激活剂和抑制剂,应用荧光淬灭动力学实验检测模型能否筛选TRPV4调节剂;加入TRPV4激活剂,应用Fura-2荧光探针法检测细胞内的Ca2+浓度;通过Z'因子评估细胞模型是否适用于高通量筛选.结果 RT-PCR和Western blotting检测结果显示,FRT细胞内源性表达TRPV4.倒置荧光显微镜下清晰可见ANO1表达在FRT细胞膜上,YFP-H148Q/I152L表达在FRT细胞质中,即成功构建了共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞模型.荧光淬灭动力学实验结果显示,该模型可以筛选TRPV4调节剂,斜率(Slope)值与TRPV4调节剂的浓度呈剂量依赖关系;该模型可敏感检测细胞内Ca2+的浓度变化,通过Slope值可反映细胞内Ca2+浓度的高低;Z'因子为0.728,表明该模型可高通量筛选TRPV4调节剂.结论 成功构建了一种可以敏感高效筛选TRPV4调节剂的高通量筛选细胞模型.