目的:探讨钙激活钾通道蛋白4（KCNN4）在甲状腺乳头状癌（PTC）中的表达情况、其与患者临床病例特征及预后的关系。方法:收集2021年1月至2021年6月在华中科技大学同济医学院附属同济医院甲状腺乳腺外科手术切除的PTC及癌旁甲状腺组织共116例，通过免疫组织化学实验检测KCNN4的表达水平，并分析不同KCNN4表达水平的患者之间的临床病例特征及预后的差异；通过细胞计数试剂盒（CCK-8）实验和划痕愈合实验检测KCNN4对PTC细胞增殖和迁移能力的影响。组间比较采用非配对 t检验；KCNN4与患者临床病理特征的关系采用 χ2检验或Fisher精确检验，生存分析采用Kalpan-Meier法。 结果:KCNN4在PTC中的表达显著高于癌旁组织（免疫组织化学评分：8.17±2.46比3.26±0.72， t＝8.44， P<0.05）；KCNN4的表达与肿瘤多灶性情况[低表达比高表达（下同），单灶为31比50，多灶为6比29， χ2＝2.24， P<0.05]、肿瘤TNM分期（Ⅰ～Ⅱ期为35比60，Ⅲ～Ⅳ期为2比19， χ2＝2.43， P<0.05）及甲状腺外侵犯显著相关（无腺外侵犯为34比59，有腺外侵犯为3比20， χ2＝2.17， P<0.05），而与患者年龄（≤55岁为12比28，>55岁为25比51， χ2＝0.32， P>0.05）、性别（男为5比16，女为32比63， χ2＝0.88， P>0.05）、是否合并有桥本甲状腺炎无关（无桥本甲状腺为23比56，有桥本甲状腺炎为14比23， χ2＝0.94， P>0.05）。KCNN4高表达患者的无复发生存率低于低表达组患者（复发率：8.86%比0%， HR＝2.42， P<0.05）；CCK-8实验表明，敲减KCNN4后的KTC-1和BCPAP细胞的增殖能力低于对照组细胞[KTC-1对照组比短发卡RNA（shRNA）转染组，72 h：1.28±0.11比0.47±0.06， t＝8.28， P<0.05；96 h：1.82±0.24比0.61±0.10， t＝10.45， P<0.05；BCPAP对照组比shRNA转染组，72 h：1.37±0.19比0.51±0.07， t＝6.14， P<0.05；96 h：2.03±0.47比0.84±0.20， t＝3.99， P<0.05]。划痕愈合实验显示，敲降KCNN4后的KTC-1和BCPAP细胞划痕愈合能力低于对照组细胞[KTC-1对照组比shRNA转染组24 h划痕愈合百分比：（66.47±7.60）%比（33.41±3.76）%， t＝6.28， P<0.05；BCPAP对照组比shRNA转染组24 h划痕愈合百分比：（71.25±9.06）%比（43.32±5.83）%， t＝12.10， P<0.05]。 结论:KCNN4与PTC发生、发展密切相关。

目的:观察内皮素受体A(ETA)抑制剂BQ-123对C57BL/6小鼠骨癌痛的镇痛效果，并探讨脊髓星形胶质细胞活化及大电导钙激活钾离子通道(BK Ca)通道的作用。 方法:选用C56BL/6雄性小鼠30只，体重18~20 g，随机数字表法分为3组( n＝10)，假手术组(S组)、癌痛组(BCP组)、BQ-123组(BQ组)。BCP组和BQ组于左下肢股骨骨髓腔内接种Lewis肺癌细胞(2×10 6个)制备骨癌痛模型。S组则注射等量D-Hanks’液。于接种后第7~21天，BQ组腹腔内注射BQ-123(10 nmol/d)，BCP组则注射等量双蒸水(10 μl/d)。于术前1 d(T0)、术后第7天(T1)、第10天(T2)、第13天(T3)、第15天(T4)、第18天(T5)、第21天(T6)测定机械痛阈值(MWT)和后足使用评分。术后第21天，取L4~L6脊髓，分别采用蛋白质印迹法(Western blot)法检测BK Ca通道蛋白、星形胶质细胞活化标志物胶质纤维状酸性蛋白(GFAP)蛋白表达，酶联免疫吸附剂测定(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素(IL)-1β的表达。正态分布资料组间比较采用单因素方差分析或重复测量资料方法分析，两两比较采用Tukey检验。 结果:BQ组于T2~T6时时间点MWT高于BCP组[(3.97±0.37) g比(3.31±0.56) g、(3.89±0.45) g比(3.22±0.88) g、(3.48±0.56) g比(2.78±0.51) g、(3.13±0.49) g比(2.20±0.33) g、(3.28±0.52) g比(1.95±0.54) g]，差异有统计学意义( q＝3.367、3.418、3.571、4.744、6.734， P<0.05)；于T3~T6时行走评分高于BCP组[(2.70±0.72) g比(2.20±0.49) g、(2.63±0.59) g比(1.77±0.40) g、(2.02±0.65) g比(1.30±0.51) g、(1.83±0.61) g比(1.27±0.52) g]，差异有统计学意义( q＝3.406、5.859、4.905、3.815， P<0.05)；脊髓BKCa通道表达明显高于BCP组(0.27±0.03比0.18±0.02)，GFAP表达低于BCP组(0.31±0.02比0.41±0.03)，差异有统计学意义( q＝3.406、7.276， P<0.05)；TNF-α和IL-1β表达低于BCP组[(286.45±15.94) pg/mg蛋白比(217.62±15.48) pg/mg蛋白、(178.28±18.26) pg/mg蛋白比(148.15±12.87) pg/mg蛋白]，差异有统计学意义( q＝8.152、4.795， P<0.05)。 结论:腹腔内注射ETA拮抗剂BQ-123可减轻小鼠骨癌痛，其机制可能与BK Ca通道表达上调、脊髓星形胶质细胞活化受抑制有关。

目的:探讨中电导钙激活钾离子通道(SK4)蛋白与甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的相关性。方法:分析88例甲状腺乳头状癌患者的组织芯片，根据SK4免疫组织化学染色结果分为SK4阳性表达组(55例)和SK4阴性表达组(33例)，细胞实验小干扰RNA(siRNA)敲除SK4的甲状腺乳头状癌细胞为实验组，甲状腺乳头状癌细胞为对照组。采用 χ2检验分析SK4表达与临床病理特征之间的关系，采用Logistic回归模型分析甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移危险因素。通过Transwell细胞迁移和侵袭实验验证SK4对甲状腺乳头状癌细胞侵袭转移的作用。采用SPSS 22.0(IBM)和Graphpad prism 5.0软件分析。应用 χ2检验和Fisher精确概率法分析组间差异，建立Logistic二元回归模型进行单因素、多因素分析。 结果:88例甲状腺乳头状癌组织中SK4阳性者为55例，阳性率为62.5%。SK4在甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移中阳性表达率为73.3%(33/45)，SK4在各临床分期中阳性表达率为，Ⅰ期66.7%(24/33)，Ⅱ期23.1%(3/13)，Ⅲ期80.6%(25/33)，Ⅳ期50.0%(3/6)， χ2检验结果显示SK4的表达水平与甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移、临床分期之间差异有统计学意义( χ2＝4.611、11.762， P<0.05)。SK4的表达与患者年龄、性别、T分期、肿瘤部位之间无统计学意义( χ2＝0.724、1.343、2.799、0.637， P>0.05)。Logistic回归分析结果显示SK4阳性和临床分期，是甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的独立危险因素( OR＝3.827、3.882， P<0.05)。SK4敲除后甲状腺乳头状癌细胞的侵袭及迁移能力的明显受到抑制，SK4敲除组侵袭及迁移能力低于对照组(224个细胞 比690个细胞；196个细胞比571个细胞； t＝185.900、138.600， P<0.01)。 结论:SK4的表达与甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移中密切相关。

目的 观察慢性心力衰竭(CHF)大鼠室旁核内大电导钙激活钾通道(BKCa)的变化及其与交感神经活动的关系.方法 雄性Wistar大鼠,6～7周龄,随机数字表法分为2组,即假手术组和CHF组.通过结扎冠状动脉左前降支的方法建立大鼠CHF模型,假手术组仅穿线不结扎.建模术后2周,对大鼠行下丘脑室旁核慢性灌注BKCa选择性阻断剂IBTX术,取假手术组和CHF组大鼠各24只,进一步分成8个亚组,即假手术+溶剂人工脑脊液(aCSF)组、CHF+aCSF组、假手术+IBTX低剂量组、CHF+IBTX低剂量组、假手术+IBTX中剂量组、CHF+IBTX中剂量组、假手术+IBTX高剂量组和CHF+IBTX高剂量组,每组6只大鼠,IBTX低、中、高剂量分别为0.125、1.25、12.5 nmol/nl.另取建模术后2周大鼠,行下丘脑室旁核微量注射病毒术,取假手术组和CHF组大鼠各12只,进一步分成4个亚组,即假手术病毒对照组、假手术基因敲减KCNMB4组、CHF病毒对照组和CHF基因敲减KCNMB4组,每组6只大鼠.超高分辨率小动物超声实时影像系统测定各组大鼠心功能指标,包括左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张末期容积(LVEDV)和左心室舒张末期内径(LVEDD)等.进一步对大鼠行右侧颈总动脉插管,通过PowerLab生物信号采集与分析系统,采集大鼠的平均动脉压(MAP)、左心室收缩压(LVSP)和左心室舒张末期压(LVEDP)等指标.在肾脏部位游离出肾交感神经,记录肾交感神经放电(RSNA),心电图采用标Ⅱ导联记录,同步得到心率.分别记录在药物或病毒干预后4周上述各指标变化.待超声心动图、血液动力学和肾交感神经记录结束后,经大鼠腹主动脉采血,ELISA法测定大鼠血浆去甲肾上腺素(NE)及血清N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)水平.取血结束后取大鼠心脏及肺脏称重,计算右心室体重比和肺重比.对大鼠心脏进行伊文思蓝染色,计算大鼠心肌梗死面积.免疫荧光和Western blot法检测大鼠室旁核内KCNMB4蛋白表达量.实时荧光定量聚合酶链反应检测大鼠下丘脑室旁核BKCa基因表达量.结果 (1)抑制下丘脑室旁核BKCa功能对大鼠心功能、血液动力学、交感驱动和组织解剖学指标的影响:CHF+aCSF组及CHF+IBTX低剂量、中剂量和高剂量组大鼠LVEF和左心室短轴缩短率均明显低于相应的假手术各组(P均＜0.05),LVEDP均明显高于相应的假手术各组(P均＜0.05),左心室最大收缩速率(+dp/dt)均明显低于相应的假手术各组(P均＜0.05).假手术+IBTX中剂量和高剂量组大鼠肾交感神经放电和心率均明显高于假手术+aCSF组,假手术+IBTX低剂量、中剂量和高剂量组大鼠MAP和血浆NE水平均明显高于假手术+aCSF组(P均＜0.05).CHF+IBTX低剂量、中剂量和高剂量组大鼠肾交感神经放电和血浆NE水平明显高于CHF+aCSF组(P均＜0.05),CHF+IBTX中剂量和高剂量组大鼠MAP和心率均明显高于CHF+aCSF组(P均＜0.05).CHF+aCSF组及CHF+IBTX低剂量、中剂量和高剂量组大鼠右心室体重比和肺重比均明显高于相应的假手术各组(P均＜0.05).(2)CHF组大鼠下丘脑室旁核内KCNMB4基因及蛋白亚基表达量:CHF组大鼠下丘脑室旁核内KCNMB4 mRNA和蛋白表达量以及KCNMB4阳性神经元数量均明显少于假手术组(P均＜0.05).(3)下丘脑室旁核内KCNMB4敲减对大鼠交感驱动、心功能和组织解剖学指标的影响:微量注射病毒后4周,假手术基因敲减KCNMB4组和CHF病毒对照组大鼠的LVEDD均明显大于假手术病毒对照组(P均＜0.05),而CHF基因敲减KCNMB4组则进一步大于CHF病毒对照组(P＜0.05),假手术基因敲减KCNMB4组和CHF病毒对照组大鼠的LVEF和左心室短轴缩短率则均低于假手术病毒对照组(P均＜0.05),而CHF基因敲减KCNMB4组则进一步低于CHF病毒对照组(P＜0.05).假手术基因敲减KCNMB4组和CHF病毒对照组大鼠的LVSP和+dp/dt均明显低于假手术病毒对照组(P均＜0.05),而CHF基因敲减KCNMB4组上述指标则进一步低于CHF病毒对照组(P＜0.05),假手术基因敲减KCNMB4组和CHF病毒对照组大鼠的LVEDP明显高于假手术病毒对照组(P＜0.05),而CHF基因敲减KCNMB4组则进一步高于CHF病毒对照组(P＜0.05).假手术基因敲减KCNMB4组大鼠的MAP、肾交感神经放电、心率和血浆NE水平均明显高于假手术病毒对照组(P均＜0.05),而CHF基因敲减KCNMB4组上述指标则均高于假手术病毒对照组和CHF病毒对照组(P均＜0.05).假手术基因敲减KCNMB4组和CHF病毒对照组大鼠右心室体重比和肺重比均明显高于假手术病毒对照组(P均＜0.05),而CHF基因敲减KCNMB4组上述指标则进一步高于CHF病毒对照组(P均＜0.05).(4)下丘脑室旁核内KCNMB4敲减对KCNMB4蛋白亚基表达量的影响:假手术基因敲减KCNMB4组、CHF病毒对照组和CHF基因敲减KCNMB4组大鼠下丘脑室旁核内KCNMB4蛋白表达水平均明显低于假手术病毒对照组(P均＜0.05),且CHF基因敲减KCNMB4组进一步低于CHF病毒对照组(P＜0.05).结论 CHF大鼠室旁核内BKCa表达下调、功能钝化,而其可能参与介导了交感传出神经活动增强,与心衰状态下心功能进一步恶化有关.

目的 探讨小G蛋白Rab5对HEK293细胞大电导钙激活钾通道(BKCa)的影响.方法 将对数生长期HEK293细胞,随机分为Control组、Rab5WT组、Rab5CA组和Rab5DN组.采用脂质体转染法进行转染,Control组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和对照质粒pcDNA3.1,Rab5WT组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和Rab5WT质粒,Rab5CA组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和Rab5CA质粒,Rab5DN组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和Rab5DN质粒,每组两种质粒总量为4μg,按质量比1∶1共转染至3.5 mm培养皿中.转染72 h、荧光显微镜下观察转染效率在70％以上时,采用膜片钳、Western blotting法和流式细胞术观察Rab5对HEK293细胞BKCa的作用.结果 与Control组比较,Rab5WT组、Rab5CA组BKCa全细胞电流密度明显增加,而Rab5DN组明显降低;Rab5WT组、Rab5CA组BKCa膜蛋白的相对表达量明显升高,而Rab5DN组明显降低(P均＜0.05);Rab5WT组、Rab5CA组Flag+/GFP+明显增加,而Rab5DN组明显降低(P均＜0.05).结论 Rab5能够明显增加表达在HEK293细胞上的BKCa电流及细胞膜上的表达,并可促进BKCa向质膜的转运过程.

目的 探讨在肾小球系膜细胞(GMCs)中,钙库操纵钙内流(SOCE)的主要通道蛋白Orai1与其下游信号分子大电导钙激活钾通道(BKCa)的物理性与功能性相互作用,及其在高糖环境下的改变.方法 采用免疫共沉淀法(co-IP)检测Orai1与BKCa相互作用;利用钙成像检测SOCE引起的细胞内游离Ca2+浓度变化;利用DiBAC4(3)作为荧光指示剂,检测SOCE引起细胞膜电位的改变;免疫蛋白电泳法检测Orai1与BKCa的表达水平.结果 在GMCs,SOCE的主要通道蛋白Orai1可与其下游信号分子BKCa通道蛋白形成信号复合物,引起GMCs膜电位超极化.高糖培养可以明显上调Orai1与BKCa蛋白的表达水平,并增强SOCE引起的膜电位超极化水平.结论 GMCs的Orai1可与BKCa形成信号复合物,参与调节细胞膜超极化过程,并可能参与高糖培养对细胞膜超极化的影响.

线粒体由内外两层膜封闭而成,其中线粒体内膜作用极为重要,呼吸链蛋白复合体附着于线粒体内膜,同时于此完成其生理功能.目前,线粒体内膜已鉴定出多种钾离子通道蛋白,如线粒体选择性钾离子通道,包括ATP依赖钾通道(mitoKATP)、电压依赖性钾通道(mitoKv 1.3)、小电导钙离子激活钾通道(mitoSKCa)、中电导钙离子激活钾通道(mitoIKCa)、大电导钙离子激活钾通道(mitoBKQ)、pH依赖钾离子通道(mitopH-sensitive K+ channels)以及TASK-3双孔钾通道(mitoTASK-3)[1-2].其中,Xu等[3]于2002年首次发现mitoBKCa在心血管疾病中扮演着极为重要的角色.随着对mitoBKCa研究的深入,发现mitoBKCa在细胞凋亡等多种生理、病理活动中也起着重要作用[4].笔者对mitoBKCa结构与功能研究的进展进行一个简要总结.

目的:探究慢性心衰大鼠下丘脑室旁核(PVN)内花生四烯酰乙醇胺(AEA)对心脏功能和交感神经活动的影响.方法:采用冠状动脉结扎法构建大鼠心衰模型,超声心动图检测心功能;PVN内连续4周分别灌注AEA、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)选择性抑制剂KN-93、瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)通道特异性阻断剂辣椒平(CPZ)、Ca2+螯合剂BAPTA-AM和小电导钙激活钾通道(SK通道)阻断剂apamin后,检测交感驱动及心功能指标;同时采用不同浓度AEA孵育NG108细胞,荧光测定法检测细胞内钙离子浓度([Ca2+]i);Western blot检测CaMKII、SK2及磷酸化TRPV1蛋白水平.结果:与假手术组相比,心衰组左心室舒张末期压(LV-EDP)明显升高,左室压力最大上升、下降速率(±dp/dtmax)和射血分数(EF)明显下降;PVN内AEA含量、[Ca2+]i及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平均显著降低;与溶剂组相比,心衰组PVN内灌注AEA可显著降低心衰大鼠死亡率和交感驱动指标,并改善心功能;然而,PVN内分别灌注KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin均显著增强交感驱动指标并恶化心功能;AEA可剂量依赖性增加NG108细胞内[Ca2+]i及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平.结论:室旁核内CaMKII/TRPV1/Ca2+/SK2信号通路可能参与了AEA对心衰大鼠心脏功能和交感神经活动的影响.

目的 探讨大电导钙激活钾通道(BK)在17β-雌二醇(E2)介导的大鼠结肠平滑肌收缩中的作用及机制.方法 24只雌性SD大鼠去除双侧卵巢后背部皮下埋植30 mm硅胶管,内含不同溶液.随机分为以下4组:(1)对照组:溶剂玉米油;(2)E2组:含质量浓度为0.3 g/L的E2,使血清E2保持在生理浓度;(3)EI组:含相同浓度E2及E2抑制剂(ICI 182780);(4)牛血清白蛋白结合E2 (BSA-E2)组:含质量浓度为0. 3 g/L的BSA-E2.各组干预14 d后,免疫荧光、Western blotting及qRT-PCR检测结肠平滑肌组织BK分布及表达.免疫荧光双标法检测BK与α肌动蛋白共表达.不同时间及不同浓度E2刺激后,Western blotting及qRT-PCR检测结肠平滑肌细胞(SMCs)中BK表达;检测E2、雌激素受体阻断剂ICI 182780、BSA-E2、雌激素α受体激动剂PPT及β受体激动剂DPN对结肠平滑肌BK表达的影响.结果 E2组结肠平滑肌BK表达高于对照组、EI组及BSA-E2组,差异有统计学意义(P<0. 05).结肠SMCs上存在BK. 50 nmol/L E2刺激24 h可显著促进BK表达.与对照组相比,E2组、雌激素β受体激动剂DPN组均可上调结肠SMCs BK表达(P<0.05). EI组、BSA-E2组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0. 05).结论 E2可上调BK表达,此作用可由β受体介导.

采用Real-time PCR、Western blot及免疫组化检测中电导钙激活钾离子通道蛋白(intermediate-conductance calcium-activated potassium channel protein,SK4/Kca3.1/KCNN4)在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)组织及细胞株中的表达情况,同时,对比研究SK4蛋白表达与PTC临床病理特征的关系.通过SK4特异性抑制剂(TRAM-34)下调SK4的表达后,采用CCK-8、平板克隆实验及Transwell实验分别检测SK4对PTC细胞株CGTHW-3增殖、集落形成及迁移能力的影响并分析其可能的分子机制.Real-time PCR、Western blot结果显示,SK4在PTC组织中的mRNA及蛋白表达量均明显高于癌旁组织(P＜0.01).免疫组化结果显示,SK4的阳性率明显高于正常甲状腺组织(P＜0.01),而SK4蛋白表达阳性率与PTC患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移等临床病理特征之间并无显著统计学意义(P＞0.05).TRAM-34可通过阻断SK4通道抑制CGTHW-3细胞的增殖、集落形成能力及迁移能力.以上结果提示,SK4通道在PTC组织及细胞中高表达,参与调控PTC细胞的增殖及迁移过程,可能与PTC发病的分子机制有关.SK4有可能成为PTC新的治疗靶点.