目的:探讨铜吸收转运蛋白(CTR1)在辐射诱导的小肠细胞放射损伤中发挥的作用及机制。方法:采用人小肠上皮细胞(HIEC)和大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)，分别经2、4、6、8 Gy和5、10、15、20 Gy X射线照射，构建放射损伤细胞模型。照后2、4、8、24、48 h收集细胞，通过Western blot检测CTR1蛋白对辐射的时间-剂量响应。将CTR1 shRNA转染入HIEC和IEC-6细胞后进行X射线照射，采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测细胞内铜水平。通过克隆形成实验确定CTR1对上述细胞辐射敏感性作用，检测活性氧(ROS)水平和DNA损伤来进一步探讨相关机制。Western blot检测X射线照射以及沉默CTR1对抗氧化蛋白Nrf2、HO-1，铜死亡相关蛋白DLAT、LIAS和FDX1表达的影响，初步确定CTR1的调控机制。结果:Western blot表明两株细胞经不同剂量的X射线照射后CTR1表达均显著上调，并且呈显著的时间剂量响应关系( t＝3.53、3.45、6.37、11.11、11.13， P<0.05)。沉默CTR1后的两株细胞放射敏感性均低于对照，增敏比分别为1.146、1.201。沉默CTR1缓解了辐射诱导IEC-6细胞内的铜蓄积( t＝3.10， P<0.05)。两株细胞照射沉默组ROS产量显著低于照射对照组( t＝5.23、2.96， P<0.05)；并且照射沉默组γ-H2AX蛋白表达较照射对照组有所减少( t＝7.50、4.29， P<0.05)。此外，X射线诱导Nrf2、HO-1蛋白表达上调；沉默CTR1后Nrf2和HO-1的表达会进一步增加。电离辐射导致铜死亡标志物DLAT以及铁硫簇蛋白LIAS、FDX1丢失，而沉默CTR1能促进上述蛋白表达水平恢复正常。 结论:CTR1沉默后的小肠细胞HIEC和IEC-6辐射抗性增强，涉及的机制可能与氧化应激和铜死亡途径有关。

微量元素铜在人体内发挥着重要生理功能,并参与体内许多重要的反应.在多细胞生物体内,铜的代谢包括吸收、分配、隔离和排泄.胞外铜离子的内流主要由高亲和力铜转运蛋白1介导,铜的利用途径包括Atox1-ATP7A/B-Cp途径、COX17-Sco1/2-CCO途径和CCS-SOD1途径,再由ATP7B介导释放到胆汁中的铜离子排出体外.铜转运系统在维持机体内铜稳态,确保组织正常功能方面起着关键性的作用.铜离子不足与过多均有危害,铜的稳态失衡可能会导致各种疾病,并与肿瘤的发生发展有关.最近的研究提出了铜死亡的概念,表明铜依赖性受控细胞死亡方式是一种不同于已知细胞死亡机制的新型细胞死亡方式.本文就铜转运系统、铜稳态失衡相关疾病与铜死亡进行综述,旨在为铜相关疾病的防治提供理论依据.

铜离子转运蛋白(CTR)是一系列参与机体铜离子吸收、转运、利用、贮存和清除等铜离子稳态调控的复杂体系,在铜离子参与调控氧化应激、能量产生、黑色素形成、神经肽生物发生和结缔组织成熟等过程中发挥重要作用.电离辐射诱导CTR表达的改变影响了铜离子在细胞中的分布,电离辐射诱导的细胞和组织中铜离子积聚伴有高亲和力铜离子转运蛋白1(CTR1)表达水平明显升高以及铜外排转运蛋白铜离子转运ATP酶α肽(ATP7A)表达水平降低,进而激活胞内氧化还原反应,加重正常组织的辐射损伤.铜死亡是一种新的细胞死亡方式,目前已成为研究热点,CTR可促进电离辐射后铜死亡的发生,推测辐射引起CTR1表达上调和ATP7A降解进而导致细胞辐射敏感性增加可能通过铜死亡途径介导,提示放射损伤的发生发展与CTR介导的铜离子稳态调控有密切关联.现对几种关键铜稳态蛋白及其之间的相互作用、CTR介导的铜离子稳态调控在正常组织辐射损伤中发挥的生物学作用和调控机制及与铜死亡的关系进行全面综述,为正常组织辐射损伤的治疗提供新策略.

Wilson 病(WD)是一种以铜代谢障碍为特征的常染色体隐性遗传病 ,系人 ATP7B 基因突变所致 ,主要影响肝脏 ,但也能影响大脑 、眼睛和肾脏 . ATP7B 基因位于常染色体 13q14 ,编码细胞内铜转运 P 型 ATP 酶 (Wilson ATP 酶 ) . Wilson ATP 酶在膳食铜与铜蓝蛋白的结合和胆汁酸排泄铜过程中发挥重要作用 . ATP7B 基因突变导致铜蓝蛋白的合成受损 ,影响铜分泌入胆汁 ,导致铜在肝脏 、脑和其他组织中蓄积[1] . WD临床表现广泛 ,可表现为无症状 、慢性肝病 、精神神经症状 、急性肝衰竭或这些症状的混合出现 ,临床上主要分为肝病型(肝脏症状为主)和神经型 (神经症状为主) . 治疗包括使用螯合剂 、D-青霉胺和三亚基四胺增加尿铜的排泄 ,或使用锌盐减少肠道铜的吸收 .

一氧化氮(NO)作为信号分子,在抵御重金属胁迫中起重要作用,但对不同离子胁迫下的解毒机制尚缺乏研究.本研究采用营养液培养法,研究了铜(Cu)、镉(Cd)单一或复合胁迫下,番茄幼苗对Cu、Cd的吸收转运特性及对外源NO的响应机制.结果表明:50 μ,mol·L-1的CH2+、Cd2+均显著抑制番茄植株的生长,其中Cd胁迫对生长的抑制效应远高于Cu胁迫.Cu、Cd单一或复合胁迫均使番茄根系Cu、Cd含量显著升高,但根系对Cu、Cd吸收存在严格选择性.根细胞对必需元素Cu表现出“奢侈吸收”的现象,而对毒性较强的Cd则吸收相对较少,胞内Cd浓度仅为Cu的1/10左右.外源NO处理可不同程度地缓解Cu、Cd胁迫,其中缓解Cd胁迫的效能更强.番茄对被动进入细胞的Cu、Cd具有相似的解毒机制:一方面,Cu、Cd胁迫诱导细胞质中产生谷胱甘肽(GSH)、植物螯合肽(PCs)和金属硫蛋白(MTs),络合过多的Cu、Cd离子,降低其生物毒性;另一方面,过多的Cu、Cd离子或螯合物被转运至液泡区隔化.外源NO通过调控GSH-GSSG(氧化型谷胱甘肽)氧化还原状态及GSH-PCs代谢方向的改变,促进Cu、Cd离子转运至液泡区隔化来缓解胁迫抑制;NO还可诱导植株叶片或根系表达更多的金属硫蛋白、GSH和PCs,而且上述响应普遍存在叠加效应.这可能是NO介导番茄对Cu、Cd胁迫的另一主要解毒途径.

铜(Cu)是植物必需的微量元素,作为多种酶的辅因子参与许多植物生理生化反应.Cu缺乏和过量均影响植物正常生长发育,因此植物进化出精妙复杂的调控网络来严格控制植物体内的Cu含量.植物Cu转运蛋白COPT家族成员与Cu有很高的亲和力,能够调节植物对Cu的吸收和转运,在维持植物体内Cu稳态平衡过程中发挥重要作用.COPT蛋白涉及不同的Cu转运功能,如从外界环境中摄取Cu、从细胞器中输出Cu、长距离运输Cu以及在不同器官间动用和再分配Cu.此外,COPT蛋白在其它离子的稳态平衡维持、昼夜节律性生物钟调控、植物激素合成和植物对激素信号的感受过程中也发挥重要作用.该文综述了模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana) COPT家族各成员的表达和定位、调控机制以及生物学功能等方面的最新进展.

目的:构建一种能够检测生活饮用水和污水中生物有效性铜离子的微生物报告菌株.方法:首先采用交叉PCR将增强型绿色荧光蛋白与铜离子"外排泵"基因copA的启动子融合构建响应铜离子的CopAp::gfpmut2-pET28a感应元件.然后利用Red重组系统分别敲除野生型大肠杆菌(E.coli)MC4100体内负责外排转运铜离子的基因,并将感应元件转化至突变菌中完成菌株的构建.最后优化出最佳检测条件,并将其初步应用于检测水环境中铜离子.结果:相对野生型菌株,E.coliΔcusA-ΔcopA-ΔcueO突变菌对铜离子的敏感性提高了64倍,从而使报告菌株的荧光信号显著增强,且荧光信号强度与铜离子浓度呈剂量依赖关系;报告菌株的线性检测范围为0.05～2.5μmol/L(0.0032～0.16 mg/L)Cu2+;与原子吸收光谱法相比,其对生活饮用水中0.05 mg/L和1 mg/L铜离子的回收率分别为87.90％和104.37％.结论:本研究构建报告菌株的灵敏度能够有效覆盖国标中针对生活饮用水和污水中铜离子的限制,从而为报告菌株的应用奠定了技术基础.

目的 研究TX小鼠ATP7B变异诱导的铜异常代谢与CTR1、ATP7A及ATP7B蛋白的关系.方法 运用RT-PCR技术对1～12月龄TX小鼠肝脏、肾脏、脑组织中CTR1 mRNA、ATP7A mRNA、ATP7B mRNA的含量进行定量检测,同时运用Western bolt技术对其相应的CTR1、ATP7A及ATP7B蛋白进行定量检测,最后运用原子吸收分光光度法定量测定各脏器组织中铜离子含量.结果 肝ATP7A mRNA、ATP7B mRNA,肾脏CTR1 mRNA、ATP7A mRNA、ATP7B mRNA的含量逐月减少,除肝脏CTR1 mRNA外其余每月mRNA的含量与翻译成的蛋白含量成相同的趋势;肝肾脑中铜离子含量最高峰分别达到937、544、252 mg/kg,仅肝脏铜离子与其CTR1 mRNA呈对应负相关性谷峰状波动.结论 当脏器铜离子含量蓄积高达到900 mg/kg上下时,机体启动负反馈调节,显著降低CTR1 mRNA含量进行控铜.TX小鼠作为模型应用不受月龄限制,但Wilson病早期干预治疗以拮抗铜转运蛋白失代偿对减轻肝细胞的损害,外源性间接或直接助力Cu2+转运因子的协调作用是重要的.

目的 探索结肠癌的预后相关基因及其与免疫细胞的相关性.方法 通过GEO数据库筛选差异表达基因(DEGs),使用R"clusterprofiler"包进行功能富集分析.筛选出预后相关基因,并通过qPCR实验验证预后相关基因的表达.使用cibersort算法分析预后相关基因与免疫细胞的相关性.结果 对GSE21510、GSE18105和GSE20916数据集进行分析并取交集,获得50个共同上调DEGs和130个共同下调DEGs,即180个交集基因.在GO功能富集分析方面,交集基因主要富集在细胞对无机物质的反应、锌离子反应、细胞锌离子稳态、铜离子解毒、对铜离子的应力响应等生物学过程(BP)上;在细胞组成(CC)方面,交集基因主要富集在细胞顶端部分、顶端质膜、质膜的外侧、基底质膜等;在分子功能(MF)方面,交集基因主要富集在离子跨膜转运体的活性、G蛋白—偶联受体结合、金属肽酶活性、羧酸跨膜转运体的活性等.在KEGG功能富集方面,交集基因主要参与矿物吸收,胆汁分泌,病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用,PPAR信号通路等.GCNT2与结肠癌预后相关,在结肠癌中低表达.免疫细胞相关性分析发现,GCNT2与幼稚B细胞、调节性T细胞、活化性自然杀伤细胞、滤泡辅助性T细胞呈正相关,与静息性自然杀伤细胞呈负相关.结论 GCNT2与结肠癌预后相关,其可能通过调节免疫细胞的活性参与结肠癌的发展.

目的:探讨铅(Pb)暴露诱导小鼠神经元铜(Cu)蓄积,促进细胞氧化应激损伤的机制.方法:C57BL/6小鼠饮用300 ppm醋酸铅水溶液2个月建立铅暴露动物模型;小鼠海马神经元细胞系HT22细胞暴露于0～100 μmol/L醋酸铅24 h,采用噻唑蓝(MTT)法筛选适宜的铅作用剂量,建立铅暴露细胞模型.石墨炉原子吸收分光光度法(AAS)检测铅暴露后小鼠脑组织和HT22细胞铜水平变化;Western Blot法检测铅暴露对小鼠脑组织和HT22细胞中铜转运蛋白1(CTR1)、铜转运ATP酶α肽(ATP7A)、铜转运ATP酶β肽(ATP7B)表达水平的影响;2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针法、硫代巴比妥酸比色法(TBA)分别测定铅暴露后HT22细胞内活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)活性变化情况,并观察特异性铜螯合剂四硫代钼酸铵(TTM)的保护作用.结果:与对照组相比,铅暴露组小鼠血铜水平降低,而皮质和海马组织铜水平均显著升高(P＜0.05);以5、10 μmol/L铅暴露24 h后,HT22细胞的铜吸收呈剂量-依赖性增高(P＜0.05).铅暴露后小鼠脑组织和HT22细胞中CTR1蛋白水平显著增高,而ATP7A和ATP7B蛋白水平显著降低(P＜0.05).铅暴露引起HT22细胞ROS、MDA水平较对照组呈剂量-依赖性升高(P＜0.05);而TTM的处理逆转了铅暴露引起的氧化应激(P＜0.05).结论:铅暴露可能通过影响神经元铜转运蛋白水平导致细胞铜蓄积,进而诱导细胞氧化应激损伤.