目的:应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法:选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型，设计3个CRISPR来源的RNA (crRNA)-crRNA001/002/003，应用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)方法转染WD肝细胞，48 h后提取基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率，筛选出效率最高者crRNA001，并设计相应的单链寡核苷酸(ssODN)修复模板；用crRNA001和ssODN共转染肝细胞，模板特异性引物行PCR，验证ssODN掺入。组间比较采用Student’S t检验。 结果:Sanger测序结果显示，crRNA001的编辑效率为(57.8±5.1)%。用ssODN共转染细胞后，模板特异性引物行PCR，能扩增出修正后的铜离子转运ATP酶β肽(ATP7B)基因条带；二代测序结果显示，ATP7B基因修复效率为(7.45±2.54)%。结论:CRISPR/Cas9 RNP转染能达到较高编辑效率，相应的ssODN可以高效修复缺陷ATP7B基因，为进一步的体内实验提供理论和实验基础。

目的 探讨铜离子载体伊利司莫诱导子宫内膜癌细胞发生铜死亡的机制.方法 采用不同浓度伊利司莫和氯化铜处理HEC-1-A细胞.细胞计数试剂-8(CCK-8)法检测细胞增殖.酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ.实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测mRNA表达.免疫印迹法(Western blotting)和免疫组化法检测蛋白表达.结果 单独加入伊利司莫或氯化铜不影响细胞的存活率,但同时加入 50 nmol·L-1伊利司莫和1 μmol·L-1铜离子使HEC-1-A细胞存活率明显下降(P＜0.01).伊利司莫诱导的HEC-1-A细胞死亡并不涉及细胞凋亡.采用50 nmol·L-1伊利司莫和1 μmol·L-1铜离子处理HEC-1-A细胞后,线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的水平显著升高.敲减人铁氧还原蛋白1(FDX1)可明显抑制HEC-1-A细胞的铜死亡(P＜0.01).此外,FDX1 在子宫内膜癌组织中低表达.结论 伊利司莫可能通过FDX1/线粒体呼吸途径促进子宫内膜癌细胞发生铜死亡.

目前肿瘤耐药性不断发展成为癌症治疗面临的主要问题.金属元素的应用越来越广泛,尤其是近年来铜死亡的发现,让我们重新聚焦铜在肿瘤治疗上的应用.而铜离子载体与铜联合使用可以提高细胞内Cu水平并发挥抗癌活性.其中双硫仑(disulfiram,DSF)成本低,高效且安全,是一种有效的铜离子载体,已被证明可以促进癌细胞死亡,包括铜死亡.DSF可以与二价铜离子螯合,产生二乙基二硫代氨基甲酸铜(Cu[DDC]2)复合物,用来抗肿瘤,还可以调节肿瘤多药耐药性(multidrug resistance,MDR).近期双硫仑联合铜在国外展开了丰富的临床试验,并验证了其疗效及安全性.该文就双硫仑联合铜抗肿瘤耐药的应用及机制研究进展进行探讨,为肿瘤耐药的干预提供借鉴.

目的 构建负载内源性一氧化氮供体催化剂铜复合物的纳米纤维小口径人工血管材料,评价其生物功能.方法 合成催化体内一氧化氮供体释放一氧化氮的铜离子复合物(Cu(II)-DTTCT).用 Cu(II)-DTTCT 和具有良好生物相容性的高分子聚合物——聚己内酯(PCL)为原材料,精确催化剂用量,同轴电纺方式制备小口径人工血管支架材料.对其进行一氧化氮释放量、铜离子复合物包载率以及细胞毒性的测定.采用 SD 大鼠作为半体外和体内评估载体.应用动静脉分流、植入材料原位移植术、活体超声检测、体式显微镜和扫描电镜观察、HE 染色等技术评价其生物功能.结果 构建以催化剂 Cu(II)-DTTCT 和 PCL 为芯,以PCL 为壳的具有芯壳结构的小口径人工血管支架材料PCL&Cu(II)-DTTCT.PCL&Cu(II)-DTTCT 在所检测时间没有出现一氧化氮明显突释现象.铜离子复合物包载率为91.60%;PCL&Cu(II)-DTTCT 纤维薄膜的细胞毒性与对照组(PCL)相比几乎没有明显差异.半体外行动静脉分流实验 1 h 后,体视显微镜下对照组 PCL 材料内壁见沉积和血小板黏附现象,实验组 PCL&Cu(II)-DTTCT 材料内壁相对干净光滑,没有明显血栓;扫描电镜下观察,对照组 PCL见大量血小板黏附,实验组 PCL&Cu(II)-DTTCT 材料上血小板很少,清晰可见人工血管纤维结构;PCL 对照组和PCL&Cu(II)-DTTCT 实验组在行人工血管原位移植术 2 周、1 个月、3 个月、6 个月后,用超声检测移入血管均通畅,均无因血管阻塞死亡情况;1 个月后活体取材后体视显微镜下实验组 PCL&Cu(II)-DTTC 管壁均匀,内腔干净,没有明显的血栓,对照组由于红细胞的浸润表面出现了一些微血栓;扫描电镜观察可见,两组管腔表面已被完全的覆盖,PCL对照组可见血小板,PCL&Cu(II)-DTTCT 实验组未见明显血小板影像;通过 HE 染色来分析血管支架的组织再生情况,对照组和实验组血管支架内腔可以观察到一层再生组织,实验组新生组织的厚度明显高于对照组.实验组有核细胞黏附高于对照组.结论 构建的负载内源性一氧化氮供体催化剂铜复合物的纳米纤维小口径人工血管材料 PCL&Cu(II)-DTTCT,可以促使一氧化氮持续释放,发挥抑制血小板黏附的生理功能,抑制血栓的形成和早期再狭窄的发生,在早期促进组织再生.

背景:抵抗炎症反应是促进损伤组织修复的重要环节,改善医用生物植入材料所造成的局部炎症反应是近几年有待解决的关键问题.目的:综述常见金属离子的抗炎作用及相关分子机制,为改善生物植入材料导致的宿主早期炎症反应提供一定理论参考.方法:利用计算机检索PubMed、Web of Science、中国知网及万方数据库中相关文献,以"金属离子,镁离子,锌离子,银离子,铜离子,炎症,抗炎作用,氧化应激,免疫调节,信号通路"为中文检索词,以"metal ions,magnesium ion,zinc ion,silver ion,copper ion,inflammation,anti-inflammatory effects,oxidative stress,immunoregulation,signaling pathway"为英文检索词进行检索,通过阅读文题和摘要进行初步筛选,最终纳入80篇文献进行结果分析与总结.结果与结论:①镁、锌、银、铜等金属离子具有良好的抗炎作用,该抗炎作用的强弱与其剂量及作用时间具有强相关性,未来可考虑通过控制离子的释放速率以及调节适宜治疗浓度以达到最佳抗炎效果.②镁离子和锌离子表现出优异的抗炎活性,镁离子常以硫酸镁等化合物形式在抗炎治疗中发挥益处,锌离子则以锌饲料作为锌的主要补充来源调节机体炎症反应.③银离子和铜离子具有一定抗炎作用,但仍以优异的抗菌活性占首要地位,主要以纳米颗粒及生物涂层等方式发挥作用.④镁、锌等金属离子可与天然提取物结合形成复合物发挥抗炎作用,该方法具有价格低廉、来源广泛的优点,是可持续的绿色途径,值得临床推广.⑤镁、锌、银、铜等金属离子通过减少宿主氧化应激损伤、调节免疫细胞、抑制核转录因子κB、Toll样受体、STAT3和NOD等炎症信号通路共同发挥抗炎作用.⑥金属离子抗炎相关分子机制是一个复杂网络,并非是某个单一通路的作用,而应该是多个信号通路的集合,目前仍有许多潜在机制尚未被发掘,未来需要更加系统地阐明各个信号通路之间的相互联系.

目的 通过体外抑菌实验探究富血小板血浆(PRP)及其复合银离子的抑菌效果,并探讨银离子对PRP释放生长因子能力的影响.方法 制备PRP、银离子溶液,以磷酸缓冲盐溶液(PBS)作为阴性对照,观察37℃条件下,PRP、银离子及二者复合物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的生长抑制情况,以及抑菌作用持续时间.ELISA测定单纯PRP及其与银离子复合后的血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)以及血管内皮生长因子(VEGF)浓度.结果 37℃条件下,相较于对照组,银离子组、PRP复合银离子组中金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌在培养皿中的生长均受到抑制.针对金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌,两组材料抑菌时间可持续至36 h,对铜绿假单胞菌的抑菌效果则在第24 h后开始减弱.PRP与银离子复合后的PDGF、TGF-β、EGF以及VEGF浓度较单纯PRP组相比,差异均无统计学意义(P=0.499、0.362、0.593、0.794).结论 PRP与银离子复合后,既保留了银离子的抑菌能力,同时银离子对PRP释放PDGF、TGF-β、EGF以及VEGF等生长因子的能力基本无影响.

[背景]金黄色葡萄球菌是目前食品和临床引起感染的重要病原菌,迫切需要开发新型抗菌药物.[目的]分析吡唑啉酮铜配合物 P-FAH-Cu-phen 对金黄色葡萄球菌的转录组影响和主要代谢信号通路.[方法]采用液体稀释法测定 P-FAH-Cu-phen 作用金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC).将终浓度 2 μg/mL的配合物分别作用于对数生长期的金黄色葡萄球菌 30 min和 2 h,进行转录组测序及分析.[结果]P-FAH-Cu-phen作用金黄色葡萄球菌的MIC和MBC分别为 2 μg/mL和 4 μg/mL.与空白对照相比,配合物处理细菌 30 min后,其差异基因共有 356 个,其中上调表达 180 个、下调表达 176 个;配合物处理细菌 2 h后,其差异基因共有 23 个,其中上调表达 3 个、下调表达 20 个.差异基因功能主要富集于膜的组成部分、细胞质、质膜、ATP结合、发病机制、金属离子结合、组氨酸生物合成过程、DNA结合、水解酶活性、跨膜转运蛋白活性、硝酸盐同化、硝酸盐代谢过程、硝酸还原酶复合物、硝酸还原酶活性等.差异基因涉及的信号通路主要有双组分系统、群体感应、氮代谢、三羧酸循环、氨基酸代谢等.[结论]影响细菌质膜组成、毒素生成、生物膜形成、细胞壁合成、能量代谢等可能是吡唑啉酮铜配合物P-FAH-Cu-phen对金黄色葡萄球菌的主要抑菌作用.研究为揭示吡唑啉酮铜配合物抑制金黄色葡萄球菌分子机制提供了理论依据.

双硫仑(disulfiram,DSF)为临床广泛应用的抗酗酒药物.然而,近年来的一些研究表明,DSF具有极强的抗肿瘤活性,已有临床试验报道其可提高肿瘤患者生存率;并对其抗肿瘤的分子机制进行了深入的阐述.另外,放射生物学研究发现DSF可以减轻射线对机体正常细胞的损伤,并通过其与铜离子形成复合物、抑制肿瘤干细胞、抑制泛素-蛋白酶体活性等机制增强肿瘤细胞的放疗敏感性,极有希望作为放化疗的辅助用药,提高放化疗疗效.本文详细论述了双硫仑抗肿瘤临床研究现状、分子机制,在肿瘤放射生物学中的研究及其应用前景.

本文研究了蒙脱土/还原氧化石墨烯负载纳米铜(MMT-rGO-CuNPs)复合抗菌材料的制备及其抗菌性能.通过X射线衍射图谱的检测,确定MMT-rGO-CuNPs复合物已经成功.为了研究复合物的抗菌活性,通过观察大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的表面形貌变化和细菌体外离子浓度变化,证明MMT-rGO-CuNPs复合物对金黄色葡萄球菌的抗菌性能要强于对大肠杆菌.

背景:研究表明双硫仑本身具有抗肿瘤活性,可联合铜(Cu)离子在体内外水平对多种肿瘤发挥抑癌作用,但关于双硫仑对骨肉瘤细胞增殖和凋亡作用的影响尚未阐明.目的:探讨双硫仑-Cu在体内外水平对骨肉瘤增殖与凋亡能力的影响以及可能的作用机制.方法:实验方案经山西医科大学动物实验伦理委员会批准(批准号为2017LL077).①体外实验:配置双硫仑在进入人体后的转换物二乙基二硫代氨基甲酸钠(diethyldithiocarbamate,DDTC)和Cu离子的复合物DDTC-Cu(0.5,1,2,3和5μmol/L),设置DDTC单药(5μmol/L)、Cu单药(5μmol/L)和空白对照组.药物处理人骨肉瘤细胞Saos-2细胞和MG-63细胞,CCK8法检测不同浓度DDTC-Cu对Saos-2细胞和MG-63细胞的增殖抑制作用;采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测DDTC-Cu对Saos-2细胞凋亡水平变化;②体内实验:取4周龄BALB/c-nu/nu雌性裸鼠共10只,随机分为DDTC-Cu组和对照组.采用异位移植方法,在裸鼠右侧背部皮下注射Saos-2细胞和Matrigel混悬液(1:1混合),注射量400μL/只;接种2周后,对照组裸鼠腹腔注射地塞米松(0.5 mg/kg,隔日1次),DDTC-Cu组裸鼠腹腔注射地塞米松(0.5 mg/kg,隔日1次)和DDTC-Cu复合物(10 nmol/g,隔日1次);观察两组荷瘤小鼠移植瘤生长情况,绘制瘤体生长曲线.接种5周后麻醉下处死动物,完整取出瘤体,免疫组织化学检测瘤体石蜡切片组织中ki67蛋白的表达水平,Western blot检测瘤体组织中细胞增殖和凋亡蛋白的表达及JNK通路蛋白表达的变化.结果与结论:①体外实验结果:DDTC-Cu组对骨肉瘤细胞的增殖抑制作用明显高于其他3组;CCK-8实验结果显示DDTC-Cu对骨肉瘤细胞增殖抑制呈剂量依赖性,两株细胞的24 h药物半抑制浓度分别为0.337μmol/L和0.487μmol/L;流式细胞学检测结果显示DDTC-Cu可呈剂量依赖性促进Saos-2细胞的凋亡;②体内实验结果:DDTC-Cu组裸鼠移植瘤的体积和质量均小于对照组;免疫组织化学结果显示,DDTC-Cu组的瘤体中ki-67蛋白表达水平较对照组降低;Western blot检测结果显示,DDTC-Cu组瘤体蛋白中p-JNK和c-jun的表达水平均上调.结果提示,双硫仑联合Cu离子在体内外水平抑制人骨肉瘤细胞增殖并促进骨肉瘤细胞凋亡,其作用机制可能与JNK通路活化有关.