目的:建立热毒宁吸入粉雾剂的质量标准.方法:通过实验对热毒宁吸入粉雾剂进行制备工艺优化,采用高效液相色谱法(HPLC)测定热毒宁吸入粉雾剂中绿原酸、栀子苷和青蒿素的含量.运用激光粒度仪测定热毒宁吸入粉雾剂的粉末粒径分布,结合药典和相关法规的要求,制定热毒宁吸入粉雾剂的质量标准.结果:15 g金银花和12 g青蒿在3倍体积的水中提取6 h,可以获得最佳的挥发油提取量,在6倍水体积,pH=2.5的条件下,提取240 min可以获得最优的绿原酸和浸膏得率.在乙醇浓度为70％,提取时间180 min,6倍加液条件下,获得最佳的栀子醇提物得率.在温度80℃、风速600 L/h,进药量3 mL/min的条件下进行喷雾干燥,发现乙醇含量为60％时为最优条件,其粒径分布在1～5 μm的体积百分数为67.6％,且得粉率为71.2％.喷雾微粉在25 ℃条件下储存1个月和3个月,药物分别降解0.25％和2.13％,水分分别增加0.02％和0.05％,且在避光和正常光照条件下无明显变化.热毒宁喷吸入雾剂中绿原酸含量不低于5.0％、青蒿素含量不低于3.2％、栀子苷含量不低于6.8％.热毒宁喷吸入雾剂中总菌落数低于1 000 cfu/g,真菌和酵母低于100 cfu/g,未检出大肠杆菌.结论:该优化后工艺可靠,含量测定的精密度、准确性、重复性均符合方法学要求,可用于热毒宁吸入粉雾剂的生产和质量控制.

为解决甲苯排放造成的环境污染问题,从家具厂附近的土壤中筛选出一株能以甲苯为单一碳源的降解菌,经形态特征和16S rDNA分析,鉴定为假单胞菌属,命名为Pseudomonas sp.M1.通过单因素实验对菌株的生长条件进行优化,并在最适生长条件下考察菌株对不同底物利用的广谱性和表面活性剂对菌株生长降解的影响.结果表明,菌株M1 对甲苯有较强的耐受性,在 30℃、pH 7.0、甲苯质量浓度 200 mg/L 的条件下,3 d 后降解率达到63.03%.除甲苯外,M1 还能以苯、乙醇为碳源和能源,在苯、甲苯、乙苯、二甲苯的复合污染物下,依然可以保持一定的生长量.非离子表面活性剂TritonX-100 具有适度的可生物降解性,对甲苯降解的促进效果最好,在 100 mg/L甲苯质量浓度下,添加 0.5 倍临界胶束浓度的TritonX-100 后甲苯降解率为 93.35%.

丹参Salvia miltiorrhiza Bge.是我国常用中药之一,在心脑血管疾病、抗炎、抗肿瘤等方面具有很好的药理活性.丹参的有效成分主要包括脂溶性丹参酮类和水溶性酚酸类等,此外还有一些多糖及含氮化合物等.在丹参类制剂的生产过程中,丹参中的有效成分尤其以丹参酮ⅡA、丹酚酸B为代表的化合物在提取和制剂的生产、储存过程中由于工艺本身以及原料的储存条件等方面影响容易受光照、温度、pH值等条件的影响发生降解,最终影响制剂的质量和药效.本文依据丹参成分稳定性的研究结果,讨论目前丹参中丹参酮类与酚酸类化合物,以及含丹参成分的中药制剂的稳定性,对近年来关于丹参中丹参酮ⅡA、丹酚酸B的稳定性的影响因素以及相关制剂的开发的研究进展进行综述,以期为丹参类制剂工艺优化提供理论参考.

[背景]作为降解木聚糖的核心酶种,木聚糖酶可以有效促进木质纤维素的消化水解,在动物养殖领域应用广泛.来源于嗜热细菌贝斯其热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii)的GH10 家族木聚糖酶CbXyn10C最适温度为 85℃,在 80℃条件下具有良好的热稳定性,具有饲料工业应用潜力.[目的]为满足饲料制粒尤其是水产饲料加工过程的工艺要求,进一步提高木聚糖酶CbXyn10C的热稳定性并阐明其耐热机理.[方法]以CbXyn10C晶体结构为基础,采用刚性氨基酸引入、疏水作用网络重排 2 种策略对其热稳定性进行理性设计,获得在 100℃条件下比活提高的单点突变体后,通过有益突变位点叠加策略进一步提升酶的热稳定性,最后采用分子动力学模拟技术分析其热稳定性提高的分子机制.[结果]共获得了 4 个稳定性提高的单点突变体A45P、T69P、F309V和A325P,其中突变体A45P效果最优.随着在A45P基础上另外 3 个突变位点的叠加,酶的热稳定性在不损失酶活的前提下得到了逐步提升.获得的四点突变体A45P/F309V/A325P/T69P的耐热性最好,其最适反应温度和熔解温度Tm值较野生型分别提高了 5℃和 6.8℃.分子动力学模拟技术分析发现 4 个位点的突变引入了新的氢键作用力且优化了疏水作用网络,进而导致酶的结构构象更加稳定.[结论]本研究不仅提高了木聚糖酶在饲料工业中的应用价值,而且对基于酶蛋白结构的稳定性分子改造提供了理论支持.

纤维素是由 β-1,4 糖苷键链接而成的葡萄糖单体聚合物,广泛分布于自然界,是一类易获取且廉价的可再生资源.自然界含纤维素材料的利用和处理是目前亟待解决的问题,筛选产纤维素酶的优良菌株并实现纤维素的有效利用具有重要意义.利用纤维素酶降解纤维素是绿色、高效和可持续的利用方式,广泛应用于工业和农业领域(养殖、能源、纺织等).因此,实现高效低成本的纤维素酶生产成为研究和发展的目标.木霉属真菌是重要的纤维素酶产生菌,具有产酶量大、酶系全和酶活性高等优点,分泌的胞外酶易于工业生产中的分离提纯.本研究以课题组前期积累和保存的25种木霉150个菌株为材料,通过刚果红平板法筛选、滤纸酶活测定和天然纤维素降解等测试,筛选出 14 株产纤维素酶能力较强的菌株(优于对照菌株里氏木霉QM9414),从中选取 3 株进行最佳产酶条件探索,如接种量、吐温80添加量、发酵培养基pH值等.初步测试结果表明,贵州木霉菌株8705在20℃条件下、摇瓶发酵9 d、在优化后的发酵培养基中产酶效果最佳,其上清液酶活可达到6.63 IU/mL.通过优化发酵温度、发酵时间和培养基成分配比等发酵条件,为资源利用打下物质基础并提供理论依据.

菌株 2-1-1 于贵州大学校园樱花树干子实体中分离,通过形态学结构、ITS 序列及系统发育树分析,鉴定其为白囊耙齿菌Irpex lacteus,对菌株 2-1-1产生的 3种木质素降解酶进行测定,发现菌株可分泌漆酶(laccase,Lac)、木质素过氧化物酶(lignin peroxidase,LiP)和锰过氧化物酶(manganese peroxidase,MnP).利用菌株 2-1-1 对固体培养基条件下 7 种染料的脱色能力进行检测,筛选出较易脱色的刚果红染料,同时采用气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectroscopy,GC-MS)分析确定经白囊耙齿菌降解的刚果红染料代谢产物,并对其进行脱色条件优化和毒力测验,试验分析表明:菌株 2-1-1 对 7 种染料均有脱色,对刚果红脱色效果较佳.GC-MS分析刚果红染料降解产物主要为联苯胺、联苯、苯乙烯、十六烷和3-硝基苯酚.单因素和综合优化脱色条件:染料浓度 50 mg/L,碳源为果糖、金属离子为锌离子、pH 7,该条件下刚果红染料脱色效果最优.优化条件下菌株 2-1-1 对刚果红染料脱色率达 91.03%,相比对照组脱色率提高 17.13%,刚果红染料经菌株 2-1-1 脱色前后毒力测试:染料原液>脱色后>清水处理,表明该菌株可降低刚果红染料毒性.

仿果蝇眼睛的抗反射纳米涂层是一种具有巨大市场潜力的生物可降解材料,可用于制造各种需要抗反射性能的光学设备.相较于物理化学法,采用微生物表达视黄素蛋白为在温和条件下制备纳米涂层提供了新思路.然而,目前抗反射涂层的关键——视黄素蛋白的表达水平较低,难以满足大规模生产.本研究通过分析筛选果蝇来源视黄素蛋白的最佳表达宿主,优化视黄素蛋白的表达水平,确定了中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)是视黄素蛋白的高效表达宿主,获得纯化的视黄素蛋白.同时,探索羊毛脂纳米乳液的制备方法,确定了特定浓度视黄素蛋白及与蜡乳液的比例为16:4,纳米涂层形成体系pH为7.0,温度为30℃时,纳米涂层的抗反射能力最佳.本研究为人工绿色可降解抗反射涂层的未来应用奠定基础,提供了蛋白表达优化思路,并通过纳米涂层的成分确定及体系成分浓度、pH及温度的优化,增强了人工抗反射纳米涂层的抗反射能力并降低了生产成本.

己二酸是一种具有重要应用价值的二元羧酸,是合成尼龙-66 的关键前体.目前,生物法生产己二酸存在生产周期长、生产效率低的问题.本研究选择一株野生型高产琥珀酸菌株大肠杆菌(Escherichia coli)FMME N-2 为底盘细胞,首先通过引入逆己二酸降解途径的关键酶,成功构建了可合成 0.34 g/L己二酸的E.coli JL00 菌株;接着,对合成路径限速酶进行表达优化,使E.coli JL01 菌株在摇瓶发酵条件下产量达到 0.87 g/L;随后,通过敲除sucD基因、过表达acs基因和突变lpd基因的组合策略平衡己二酸合成前体的供应,优化菌株E.coli JL12 己二酸产量进一步提升至 1.51 g/L;最后,在 5 L发酵罐上对己二酸发酵工艺进行优化.工程菌株经 72 h分批补料发酵,己二酸的产量达到 22.3 g/L,转化率为 0.25 g/g,生产强度为 0.31 g/(L·h),具备了一定的应用潜力.本研究可为包括己二酸在内的多种二元羧酸细胞工厂的构建提供理论依据和技术基础.

对一株保存的裂褶菌Schizophyllum commune Fr.的产酶能力进行测定,在苯胺蓝和愈创木酚平板上出现褪色反应和红棕色氧化圈,表明该菌株具有较强产过氧化物酶和漆酶能力.在单因素试验和均匀试验的基础上,通过人工神经网络算法优化液体发酵的产酶条件,优化后漆酶酶活达到29.385 U/mL.应用玉米秸秆栽培裂褶菌,发现降解木质素的酶类主要为漆酶,在菌丝满袋时漆酶酶活达到最大 48.333 U/mL,具有较强降解木质素能力,在工业、农业等方面具有较广阔的开发应用前景.

饲料生产贮藏时常被真菌毒素污染,主要包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A和T-2 毒素,真菌毒素会对畜禽造成严重的身体伤害甚至死亡,而真菌毒素的共存将导致更大程度的经济损失.真菌毒素的降解主要包括化学降解法、物理降解法和生物酶解法,而生物酶解法相比于另外两种方法更为环保、高效,因此备受关注.本文对毒性强、污染广的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的危害机制、降解途径以及相关的真菌毒素降解酶进行详细分析及探讨.利用分子对接等手段揭示了毒素小分子在降解反应中与真菌毒素降解酶的相互作用,并筛选出了降解过程中的关键氨基酸.虽然酶解法在去除真菌毒素方面具有优势,但是由于成本高等原因目前应用仍然受限,急需进一步研究和开发.因此,优化酶解法的工艺和条件,以实现高效、经济地去除真菌毒素将成为未来研究重点.本研究为指导真菌毒素降解酶的设计和优化提供了重要参考.