目的:分析马钱子总碱的有效成分,观察马钱子总碱治疗家兔膝关节软骨损伤的作用机制.方法:采用醇提取-有机溶剂萃取法制备马钱子总碱.通过高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术分析马钱子总碱的有效成分.从36 只家兔中随机选取6 只作为假手术组,其余家兔建立膝关节软骨损伤模型.将造模成功的家兔随机分为模型组、马钱子总碱高剂量组(24 mg·kg-1)、中剂量组(12 mg·kg-1)、低剂量组(6mg·kg-1)及氟比洛芬组(37.5 mg·kg-1),每组 6只,每天给药1 次,连续2 周.采用高频X射线机观察膝关节形态,根据家兔运动情况进行疼痛评分.HE染色观察膝关节软骨的病理形态,ELISA法检测关节冲洗液中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)含量.结果:马钱子总碱的有效成分包括马钱子碱、士的宁、伪马钱子碱、马钱子碱氮氧化物、士的宁氮氧化物、依卡精及番木鳖次碱等.与假手术组比较,模型组家兔的膝关节X线K-L评分升高(P<0.01);与模型组比较,马钱子总碱低剂量、高剂量组及氟比洛芬组家兔的膝关节X线K-L评分降低(P<0.01).与假手术组比较,模型组家兔的疼痛评分、膝关节软骨Pelletier评分升高(P<0.05);与模型组比较,马钱子总碱各个剂量组家兔的疼痛评分、膝关节软骨Pelletier评分降低(P<0.05).HE染色显示,模型组家兔膝关节滑膜细胞增生,软骨层破坏.马钱子总碱各个剂量组和氟比洛芬组家兔膝关节软骨组织未见明显滑膜或软骨下骨病变.与假手术组比较,模型组家兔关节冲洗液中TNF-α、PGE2、IL-6 含量升高(P<0.01);与模型组比较,马钱子总碱高剂量组家兔关节冲洗液中TNF-α、PGE2 含量降低(P<0.05).结论:马钱子总碱可能通过马钱子碱、士的宁等有效成分,调控膝关节炎症因子水平,从而发挥改善膝关节软骨损伤的作用.

运用动物模型、血浆药物化学及代谢组学方法,探讨马钱子炮制前后干预炎症大鼠作用机制.按不同剂量灌胃小鼠,以死亡率初步考察炮制前后毒性;建立大鼠蛋清性足跖肿胀模型,通过肿胀率和炎性因子水平评价炮制前后抗炎效果;采用高分辨质谱结合多元统计学,鉴定入血后的移行成分及相应的代谢产物;比较分析各实验组代谢轮廓及差异生物标志物,并构建其代谢通路.结果显示,高剂量下马钱子砂烫品的毒性要明显低于生品.生品和砂烫品均能显著降低大鼠足肿胀率和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)的水平,炮制前后在抗炎效果上差异无统计学意义(P＞0.05).通过血浆药物分析,鉴定出了 12个移行成分,以及相应60个代谢产物,S-plot鉴定出10个差异性化合物.代谢组学实验共发现10个内源性代谢物含量发生显著变化(P＜0.05),生物标志物主要涉及苯丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢、谷氨酸及谷氨酰胺循环、精氨酸和脯氨酸代谢等途径.通过本研究确证马钱子生品和砂烫品均有较好抗炎治疗作用,高温炮制可以降低马钱子毒性;入血后有效成分应多为生物碱,经过Ⅰ相反应就容易被体内清除;马钱子炮制抗炎、镇痛、减毒机制主要与氨基酸和脂质代谢相关.该实验结果进一步阐明了起效物质基础及体内作用机制,为后续炮制工艺改进和新药研发等提供科学支撑.

目的 本研究旨在分析马钱子碱(brucine)对分离的单个豚鼠心室肌细胞钠电流(INa+)的作用,并探索其抗心律失常的可能机制.方法 共选取24只健康的成年豚鼠作为实验对象,雌雄不拘,随机分为4组,每组6只:第1组是未接受任何处理的对照组,之后通过微量加样器使培养皿中brucine药物的终浓度分别达到3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L.采用急性酶解法分离获得单个豚鼠心室肌细胞,通过全细胞膜片钳技术测量离子通道电流,以检测不同浓度的brucine对豚鼠心室肌细胞INa+的影响.结果 正常的对照组没有明显的INa+电流峰值的变化,而brucine 3μmol/L组给药前后基本不影响INa+电流峰值,当brucine的浓度增加到10 μmol/L时,给药前后INa+电流峰值显著下降(P＜0.05),在30 μmol/L组给药前后INa+电流峰值大幅度减少(P＜0.01),并且这种抑制作用呈浓度依赖性.正常对照组及brucine 3 μmol/L剂量组中,电流-电压曲线(Ⅰ～Ⅴ曲线)并未受到显著的影响;然而,10 μmol/L、30μmol/L剂量组与对照组比较,INa+的Ⅰ～Ⅴ曲线上移,无平行移动,且曲线形状不变.结论 Brucine能够通过抑制心室肌细胞钠通道电流发挥抗心律失常作用.

基于Toll样受体 4(Toll-like receptors 4,TLR4)/肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)/基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)信号通路探索马钱子水提物(aqueous extract of Strychni Semen,SA)改善类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)大鼠疼痛的作用机制.首先通过TCMSP、TCMID、ETCM等数据库以及相关文献查找马钱子的主要化学成分;借助TargetNet和SwissTargetPrediction等数据库查找马钱子化学成分的主要作用靶点;通过GeneCards、OMIM和TTD等数据库获取RA和疼痛的主要靶点;Venny 2.1.0 平台获取三者的交集靶点;利用STRING平台和Cytoscape 3.6.1 软件构建蛋白互作网络.随后利用AutoDock Vina软件进行分子对接验证.最后建立Ⅱ型胶原诱导型关节炎(type Ⅱ collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型,up-down法和丙酮法检测大鼠机械痛敏及冷痛敏反应,评价SA对CIA大鼠的镇痛作用;通过苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色评价CIA大鼠关节组织病理学变化.采用免疫组织化学法、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测关键靶点蛋白的表达水平,实时荧光定量聚合酶链式反应法(real-time PCR)检测关键靶点mRNA的表达水平.网络预测结果表明,马钱子可能通过作用于TLR4/TNF-α/MMP-9信号通路发挥镇痛作用.进一步分子对接结果显示,SA主要活性成分马钱子碱与TLR4、TNF-α、MMP-9蛋白受体均有较强结合能力.实验验证结果显示,SA对CIA大鼠的机械刺激痛敏及丙酮刺激冷痛敏反应均具有较好的改善作用(P<0.05,P<0.01),且可显著降低CIA大鼠关节组织病理学评分(P<0.01);此外,SA中、高剂量可显著降低TNF-α、TLR4、MMP-9蛋白和mRNA表达水平(P<0.05,P<0.01).综上,SA对CIA大鼠机械刺激痛敏、丙酮刺激冷痛敏反应及关节组织病理改变均具有较好的改善作用,其作用机制可能与抑制TLR4/TNF-α/MMP-9 信号通路过度活化有关.

马钱子为临床常用中药之一,具有通络止痛、散结消肿之功,其主要化学成分为生物碱、环烯醚萜苷、黄酮类苷和类固醇等.马钱子具有镇痛抗炎、促进骨折愈合及软骨损伤修复、兴奋神经、保护心脏、抗肿瘤、抑制微生物生长和免疫调节等多种药理作用,但也不可忽视其严重的生物毒性,包括肾脏毒性、肝脏毒性、心脏毒性、神经毒性等,可通过炮制、配伍等方法达到减毒的目的.目前关于马钱子药理、毒理机制及作用靶点的研究还不够深入,未来可通过蛋白质组学、代谢组学、网络药理学及网络毒理学等多种方法对马钱子进行全面、系统的研究,并依靠现代技术开发更加安全高效的减毒方法,为马钱子临床应用和新药研发提供科学依据.

目的:分析马钱子总生物碱对类风湿性关节炎(RA)大鼠的作用及对磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)通路的影响.方法:50 只Wistar大鼠随机分为对照组、RA组、RA+马钱子总生物碱组(100 mg·kg-1)、RA+PI3K抑制剂组(20 mg·mL-1 LY294002)、RA+马钱子总生物碱+PI3K激活剂组[100 mg·kg-1 马钱子总生物碱+20 μg·kg-1 胰岛素样生长因子 1(IGF-1)],除对照组外,其余各组均构建RA模型并根据剂量给药,计算每只大鼠关节评分,测定大鼠血清抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)、丙二醛(MDA)水平;苏木精-伊红(HE)染色观察评估大鼠膝关节滑膜组织病理,比较各组Mankin评分、炎细胞浸润数、软骨厚度;测定滑膜组织白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核转录因子(NF)-κB受体活化因子配体(RANKL)水平;蛋白免疫印迹(Western blot)测定大鼠滑膜组织PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达.结果:1)对照组大鼠关节软骨组织结构正常,表面光滑完整,腔隙内组织有良好的完整软骨细胞;RA组关节表面广泛侵蚀,形态无规则,软骨细胞明显丢失,炎性细胞大量浸润,关节软骨厚度低,细胞间基质显著丢失,滑膜中单核炎性细胞浸润可见;RA+马钱子总生物碱组、RA+PI3K抑制剂组呈现保护性体征,关节表面侵蚀降低,炎性细胞浸润减轻,关节软骨厚度增加;与RA+马钱子总生物碱组相比,RA+马钱子总生物碱+PI3K激活剂组关节软骨损伤加重.2)与对照组相比,RA组大鼠关节炎症评分、血清ACPA及MDA水平、Mankin评分、炎细胞浸润数、滑膜组织IL-1β、IL-6、TNF-α、RANKL升高(P＜0.05),软骨厚度降低(P＜0.05);与RA组相比,RA+马钱子总生物碱组、RA+PI3K抑制剂组大鼠关节炎症评分、血清ACPA及MDA水平、Mankin评分、炎细胞浸润数、滑膜组织IL-1β、IL-6、TNF-α、RANKL降低(P＜0.05),软骨厚度升高(P＜0.05);与RA+马钱子总生物碱组相比,RA+马钱子总生物碱+PI3K激活剂组大鼠关节炎症评分、血清ACPA及MDA水平、Mankin评分、炎细胞浸润数、滑膜组织IL-1β、IL-6、TNF-α、RANKL升高(P＜0.05),软骨厚度降低(P＜0.05).3)与对照组相比,RA组大鼠滑膜组织磷酸化(p)-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 升高(P＜0.05);与 RA 组相比,RA+马钱子总生物碱组、RA+PI3K抑制剂组大鼠滑膜组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR降低(P＜0.05);与RA+马钱子总生物碱组相比,RA+马钱子总生物碱+PI3K激活剂组大鼠滑膜组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高(P＜0.05).结论:马钱子总生物碱可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路缓解RA大鼠炎症.

目的 采用G蛋白偶联受体及酶活检测实验方法,探究痹祺胶囊对类风湿性关节炎关键靶点的调节作用,明确其作用机制.方法 选取与抑制滑膜炎症相关的靶点[环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)、核因子-κB(nuclear factor-KB,NF-κB)、趋化因子受体 4(C-C chemokine receptor type 4,CCR4)],与抑制血管翳生成相关的靶点[血管内皮生长因子受体(vascularendothelial growth factorreceptor2,VEGFR2/KDR)],与抑制基质降解相关的受体[基质金属蛋白酶-3(matrixmetalloproteinase-3,MMP-3)],以及与活血相关的靶点[凝血酶、磷酸二酯酶(cGMP-inhibited 3',5'-cyclic phosphodiesterase,PDE3A)、肾上腺素受体 α1(alpha-1A adrenergic receptor,ADRA1A)]为研究载体,通过胞内钙离子荧光和酶抑制剂检测技术评价痹祺胶囊中19个主要单体成分对受体的拮抗作用以及对酶的抑制活性.结果 19个化合物中,士的宁、党参炔苷、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、迷迭香酸、人参皂苷Rb1、阿魏酸、藁本内酯、牛膝皂苷D可显著抑制COX-2活性;马钱子碱、士的宁、党参炔苷、白术内酯Ⅲ、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、藁本内酯、蜕皮甾酮、甘草苷可显著抑制NOS活性;丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B对NF-κB有较好拮抗作用;藁本内酯、牛膝皂苷Ⅳ、甘草次酸可拮抗CCR4;茯苓酸、牛膝皂苷Ⅳ、丹酚酸B、藁本内酯、甘草次酸能抑制VEGFR2/KDR;党参炔苷、丹参素、丹酚酸B、迷迭香酸、藁本内酯可抑制MMP-3活性;丹参素、丹参酮ⅡA、阿魏酸可抑制凝血酶活性,迷迭香酸、丹酚酸B、藁本内酯、甘草苷可抑制PDE3A活性;马钱子碱、士的宁、藁本内酯、牛膝皂苷Ⅳ、甘草次酸可拮抗ADRA1A.结论 痹祺胶囊可能通过干预COX-2、NOS、NF-κB、CCR4、VEGFR2/KDR、MMP-3、凝血酶、PDE3A及ADRA1A等关键靶点,发挥抗炎止痛、抑制血管翳形成及基质降解、活血作用,进而起到治疗类风湿性关节炎的药效作用.其药效物质基础可能为马钱子碱、士的宁、党参炔苷、白术内酯Ⅲ、茯苓酸、丹参素、迷迭香酸、阿魏酸、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、藁本内酯、蜕皮甾酮、牛膝皂苷D、甘草次酸、甘草苷.

目的 探究痹祺胶囊祛风除湿、活血止痛功能的药效物质基础.方法 通过建立脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7体外炎症模型、细胞核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-stimulating factor,M-CSF)与 RAW264.7 细胞共培养建立破骨细胞分化模型、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞RA-HFLS增殖模型,分别探讨痹祺胶囊发挥抗炎活性、抑制破骨细胞形成、抑制RA-HFLS细胞增殖的作用机制及药效物质基础.MTS法检测细胞增殖活性,ELISA法检测细胞上清中一氧化氮(nitric oxide,NO)、TNF-α和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的含量,TRAP染色法检测破骨细胞分化数量,流式细胞术检测细胞凋亡情况,RT-qPCR法检测细胞中组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)、基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)、RANKL mRNA相对表达情况.结果 痹祺胶囊及其19个单体成分均能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞内NO、TNF-α和IL-6的释放,推测19个化合物是痹祺胶囊发挥抗炎作用的药效物质基础.痹祺胶囊及其13个单体成分均能显著减少RANKL和M-CSF诱导RAW264.7分化为破骨细胞的数量,并能明显降低破骨细胞标志基因CTSK和TRAP的相对表达量,推测马钱子碱、士的宁、党参炔苷、茯苓酸、丹参素、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、藁本内酯、甘草次酸和甘草苷为痹祺胶囊发挥治疗骨破坏、缓解关节疼痛作用的主要物质基础.痹祺胶囊及其9个单体成分能明显抑制TNF-α诱导的RA-HFLS细胞增殖,并且能显著促进RA-HFLS细胞的凋亡以及明显降低MMP-3和RANKL基因的相对表达量,推测马钱子碱、士的宁、丹参素、丹参酮ⅡA、阿魏酸、藁本内酯、蜕皮甾酮、次黄嘌呤、甘草次酸为痹祺胶囊中发挥抑制滑膜增生作用的药效物质基础.结论 通过体外细胞实验初步确定马钱子碱、士的宁、党参炔苷、白术内酯Ⅲ、茯苓酸、丹参素、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、阿魏酸、藁本内酯、蜕皮甾酮、牛膝皂苷D、次黄嘌呤、甘草次酸、甘草苷为痹祺胶囊主要药效物质基础.

目的 建立痹祺胶囊的HPLC指纹图谱及甘草苷、阿魏酸、丹酚酸B的含量测定方法,更为全面地评价痹祺胶囊的质量.方法 采用Shiseido Capcell PakC18MG Ⅱ色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),指纹图谱以乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,体积流量1.0 mL/min,检测波长203 nm,柱温为35 ℃,测定19批痹祺胶囊指纹图谱,结合中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行全面分析;含量测定以乙腈-水-0.1％磷酸水溶液(21∶79∶0.1)为流动相;体积流量1.0mL/min;以二极管阵列检测器检测,甘草苷检测波长为276 nm,阿魏酸检测波长为321 nm,丹酚酸B检测波长为286 nm;柱温为40 ℃;进样体积均为10μL.结果 19批痹祺胶囊指纹图谱相似度大于0.97,共标定了 36个共有峰,确认了 6号峰为丹参素、10号峰为士的宁、11号峰为马钱子碱、13号峰为甘草苷、14号峰为阿魏酸、15号峰为迷迭香酸、16号峰为人参皂苷Rg1、18号峰为丹酚酸B、20号峰为人参皂苷Rb1、22号峰为甘草酸铵、27号峰为藁本内酯、30号峰为丹参酮ⅡA、33号峰为茯苓酸13个成分;含量测定中甘草苷、阿魏酸、丹酚酸B进样量在30.35～455.30 ng、5.046～75.690 ng、61.79～926.90 ng线性关系良好(均为r=0.999 9);平均回收率在98.43％～102.12％,RSD均＜2％;19批痹祺胶囊中甘草苷质量分数在0.630～1.428 mg/g,阿魏酸质量分数在0.188～0.260mg/g,丹酚酸B质量分数在2.539～3.442 mg/g.结论 建立的指纹图谱及含量测定方法适用于痹祺胶囊的全面质量评价.

目的 提升接骨丹片的质量标准.方法 采用薄层色谱法鉴别制剂中的制马钱子和大黄;采用高效液相色谱法同时测定马钱子碱和士的宁的含量,色谱柱为Kromasil 100-5-C18柱(250 mm×4.6 cm,5μm),流动相为乙腈-0.01mol/L庚烷磺酸钠与 0.02mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液进行梯度洗脱,流速为 1.0 mL/min,检测波长为 260 nm,柱温为 30℃,进样量为 10μL.结果 制马钱子、大黄的薄层色谱图斑点清晰,分离度高,且阴性对照无干扰.马钱子碱和士的宁的质量浓度分别在 1.46～116.73μg/mL和 1.60～128.30μg/mL范围内与峰面积线性关系良好(r = 0.999 5,0.999 7,n = 6);精密度、重复性、稳定性试验结果的RSD均小于 2.0%(n = 6);平均加样回收率分别为 97.28%和 96.23%,RSD分别为 1.16%和 1.36%(n = 6).结论 该方法专属性好,结果准确、可靠,可用于接骨丹片的质量评价.