目的 探讨骨碎补(rhizoma drynariae,Rhd)对骨髓腔内脂肪异常积累引起的脂毒性介导成骨细胞焦亡的影响及其机制.方法 体内构建卵巢摘除(ovariectomy,OVX)骨质疏松小鼠模型,用Rhd进行灌胃,给药 8 周后称重,取股骨组织和血清.HE染色观察髓腔内脂肪堆积状态.体外构建成脂-成骨细胞共培养系统,茜素红S(alizarin red S,ARS)染色观察钙化结节的数量,碱性磷酸酶(alkaline phosphatease,ALP)染色检测碱性磷酸酶活性水平,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测和Hoechst33342/PI染色检测共培养下成骨细胞(osteoblasts,OBs)焦亡水平,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞培养上清液中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的释放量,Western blot检测成骨能力相关蛋白Runt相关转录因子 2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、骨形态发生蛋白 2(bone morphogenetic protein,BMP2)和 1 型胶原蛋白(collagen-1,COL-1).选择NLRP3 特异性抑制剂MCC950 作为阳性对照检测焦亡相关蛋白NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白 3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)、半胱天冬酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,CASP-1)、效应蛋白消皮素D(gasdermin D,GSDMD)、IL-1β和IL-18 的表达.结果 OVX小鼠髓腔内发生骨质流失伴大量脂肪堆积,Rhd灌胃可以有效缓解这一趋势.在成脂-成骨共培养系统中,共培养环境抑制了OBs活性和OBs中ALP 活性及矿化结节,抑制了RUNX2、BMP2、COL-1 蛋白表达,并且诱导焦亡发生,提高了LDH释放量和PI染色细胞阳性率,以及上调NLRP3、CASP-1、GSDMD、IL-1β和IL-18 蛋白表达水平.而这一趋势在Rhd干预后得到逆转.结论 大量脂肪堆积引起的脂毒性可以抑制OBs活性并通过激活NLRP3 炎症小体诱导OBs焦亡,而Rhd可能通过抑制NLRP3 炎症小体的激活以抑制OBs焦亡和炎性反应,从而起到抗骨质疏松的作用.

目的:探讨微小RNA（miR）-153-3p如何与α-突触核蛋白（snca）相互作用影响小鼠的骨质疏松进程。方法:采用切除双侧卵巢构建骨质疏松（OVX）小鼠模型（品系），通过苏木精-伊红（HE）染色明确病理学改变。通过实时荧光定量反转录聚合酶链反应、免疫蛋白印记实验和免疫组织化学染色对目标基因的信使RNA（mRNA）及蛋白表达进行定量。核因子-κB活化因子受体配体（RANKL）处理小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7细胞）后，显微镜下观察细胞形态，噻唑蓝（MTT）法评价细胞活力，Transwell实验检测破骨细胞迁移能力；双荧光素酶实验验证miR-153-3p与snca的相互作用。结果:snca在OVX小鼠中低表达（ t＝11.436， P<0.05），miR-153-3p在OVX小鼠中高表达（ t＝15.833， P<0.05）。抑制miR-153-3p或过表达snca抑制骨质疏松，snca在RANKL诱导的RAW264.7细胞中低表达（ t＝11.796， P<0.05），miR-153-3p在RANKL诱导的RAW264.7细胞中高表达（ t＝10.448， P<0.05）。过表达snca抑制破骨细胞分化[抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）： t＝7.493， P<0.05；Cathepsin K： t＝9.536， P<0.05；基质金属蛋白酶（MMP）-9： t＝20.371， P<0.05；MMP-2： t＝31.924， P<0.05]。miR-153-3p通过抑制snca表达促进破骨细胞分化（ F＝123.390， P<0.05），过表达snca能恢复过表达miR-153-3p的效果（ F＝136.515， P<0.05）。双荧光素酶及蛋白检测实验结果表明miR-153-3p能负向调控snca的表达（ F＝92.528， P<0.05）。 结论:抑制miR-153-3p通过促进snca表达抑制破骨细胞功能，进而抑制小鼠体内骨质疏松进程。

目的:通过建立并观察骨质疏松小鼠模型中骨内H型血管（CD31/EMCN染色双阳性）的表现，探讨骨密度与骨内H型血管的变化关系。方法:选取雌性8周龄野生型C57BL/6J小鼠30只，分为假手术组、切除卵巢组（ovariectomy，OVX组），每组15只。假手术组手术中仅暴露双侧卵巢，并切除其周围少许脂肪组织；OVX组手术中完整切除双侧卵巢。4周后取材股骨标本以无菌纱布包裹暂存于生理盐水中，以备Micro CT扫描观察骨密度及骨小梁显微结构的变化。取材胫骨标本并剔除其表面软组织，经固定、脱钙、脱水及包埋等处理，进行免疫荧光染色观察两组小鼠骨标本中H型血管的变化，检测两组数据并行统计学分析。结果:经Micro CT扫描，OVX组骨密度为（0.11±0.01）g/cm 3，假手术组为（0.21±0.01）g/cm 3，差异有统计学意义（ P=0.001）。骨小梁显微结构发生变化：OVX组骨小梁体积分数为11.52%±1.77%，假手术组为25.87%±1.31%，差异有统计学意义（ P<0.05）；OVX组骨小梁数目为（1.67±0.33）个/mm，假手术组为（2.95±0.82）/mm，差异无统计学意义（ P=0.07）；OVX组骨小梁厚度为（0.06±0.01）mm，假手术组为（0.07±0.01）mm，差异有统计学意义（ P=0.021）。OVX组骨小梁间隙为（0.29±0.15）mm，假手术组为（0.19±0.01）mm，差异有统计学意义（ P<0.05）。除两组间骨小梁数目无统计学意义以外，其余两组骨小梁参数间的差异存在统计学意义（ P<0.05）。两组小鼠的骨标本经免疫荧光染色的标准流程处理后，分别计算两组骨标本同一部位H型血管的显像面积，OVX组H型血管的面积占比为9.14%±0.99%，而假手术组H型血管面积占比为29.33%±1.22%，OVX小鼠胫骨干骺端H型血管较假手术组显著减少，两组间差异存在显著的统计学意义（ P<0.05）。 结论:在切除小鼠双侧卵巢模拟绝经后骨质疏松症的模型中，骨密度及骨小梁显微结构发生变化的同时也存在骨内H型血管的改变，这提示H型血管可能参与了绝经后骨质疏松症的发生。

目的:探讨miR-204通过Wnt信号通路对骨质疏松症小鼠成骨细胞增殖的影响及机制分析。方法:雌性昆明小鼠分为：对照组、假手术组和骨质疏松症组，采用双侧卵巢切除法建立去卵巢骨质疏松小鼠模型并进行鉴定；提取小鼠原代成骨细胞并鉴定；细胞转染并检测miR-204的表达水平；MTT检测各组细胞活力；各组细胞碱性磷酸酶（ALP）活性的检测；Transwell检测各组细胞的侵袭能力；细胞流式术检测各组细胞凋亡情况；细胞流式术检测各组细胞Caspase-3活性；双荧光素酶报告基因检测miR-204和 β-catenin、LRP-5间的相互作用；Western blot检测Wnt信号通路相关蛋白表达情况。 结果:骨质疏松症组小鼠骨密度较对照组和假手术组明显降低（ P=0.007， P=0.057），表明骨质疏松症小鼠造模成功。miR-204的表达水平在miR-204模拟物组明显提高（ P=0.072），在miR-204抑制剂组下降（ P=0.031）；miR-204模拟物组成骨细胞活力和ALP活性提高（ P=0.007， P=0.043），miR-204抑制剂组成骨细胞活力和ALP活性下降（ P=0.007， P=0.035）；miR-204模拟物组成骨细胞的侵袭能力明显增强（ P=0.006），miR-204抑制剂组成骨细胞的侵袭能力下降（ P=0.036）；miR-204模拟物组成骨细胞的凋亡能力和Caspase-3活性下降（ P=0.041， P=0.045），miR-204抑制剂组成骨细胞的凋亡能力和Caspase-3活性增强（ P=0.005， P=0.039）；miR-204与 β-catenin、LRP-5之间有靶向关系；miR-204模拟物组成骨细胞中 β-catenin和LRP-5蛋白表达均上调（ P=0.043， P=0.009），miR-204抑制剂组成骨细胞中 β-catenin和LRP-5蛋白表达均下调（ P=0.041， P=0.032）。 结论:miR-204可能促进成骨细胞的增殖，激活Wnt信号通路，对骨质疏松症有一定的保护作用。

目的:探讨去铁胺通过影响骨内H型血管对骨密度的改善情况。方法:选取雌性8周龄野生型C57BL/6J小鼠30只(实验动物来自南京大学动物模式所)，分为3组：假手术组(Sham组)、切除卵巢组(OVX组)及切除卵巢注射去铁胺组(OVX＋DFO组)，10只/组。Sham组手术中仅暴露双侧卵巢，并切除其周围少许脂肪组织；OVX组手术中结扎双侧输卵管并完整切除双侧卵巢；OVX＋DFO组切除双侧卵巢后腹腔注射DFO，隔日1次。4周后取材股骨标本以观察骨密度及骨小梁显微结构的变化。取材胫骨标本观察组间小鼠骨标本中H型血管的变化，检测H型血管的量，并采用方差分析进行相关数据的处理。结果:3组小鼠骨密度分别为Sham组(0.18±0.01) g/cm 3，OVX组(0.12±0.00) g/cm 3，OVX＋DFO组(0.16±0.01) g/cm 3，OVX＋DFO组较OVX组骨密度明显改善，组间差异有统计学意义( F＝20.790， P<0.01)。骨小梁显微结构的变化：骨小梁体积分数OVX组为(11.47±0.79)%，Sham组为(26.05±2.05)%，OVX＋DFO组为(18.44±3.26)%，骨小梁体积分数OVX组较Sham组明显减少，而OVX＋DFO组得到改善，组间差异有统计学意义( F＝31.000， P<0.01)。骨小梁的数目Sham组为(2.81±0.13)个/mm，OVX组为(1.63±0.15)个/mm，OVX＋DFO组为(2.36±0.43)个/mm，骨小梁数目OVX组较Sham组减少，而DFO干预后每毫米长度骨小梁数目增加，组间差异有统计学意义( F＝14.290， P<0.01)。骨小梁厚度OVX组为(0.05±0.01) mm，Sham组为(0.07±0.00) mm，OVX＋DFO组为(0.06±0.00) mm，组间差异有统计学意义( F＝20.060， P<0.01)。骨小梁间隙OVX组为(0.29±0.03) mm，Sham组为(0.19±0.01) mm，OVX＋DFO组为(0.24±0.04) mm，组间差异有统计学意义( F＝9.450， P<0.05)。骨小梁连接密度Sham组为(202.67±37.75)/mm 3，OVX组为(97.85±8.62)/mm 3，OVX＋DFO组为(115.79±15.90)/mm 3，组间差异有统计学意义( F＝16.140， P<0.01)。3组小鼠的胫骨标本经免疫荧光染色的标准流程处理后，分别计算各组骨标本干骺端H型血管的面积占比，Sham组H型血管面积占比为(26.28±1.23)%，OVX组H型血管的面积占比为(8.72±0.85)%，OVX＋DFO组H型血管的面积占比为(17.25±2.14)%，可见骨质疏松症小鼠骨内H型血管明显减少，而DFO干预组骨内H型血管较OVX组增加，组间差异有统计学意义( F＝160.000， P<0.01)。 结论:在骨质疏松症的小鼠模型中，H型血管参与了骨质疏松症的发生，去铁胺可能通过增强骨内H型血管从而改善骨密度。

目的:观察小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3来源的外泌体对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨效应的影响。方法:通过超高速离心法提取bEnd.3细胞来源的外泌体(b-Exo)，利用透射电子显微镜(TEM)、纳米粒径追踪分析(NTA)和外泌体蛋白标志物蛋白质印迹法(Western blot)实验鉴定所提取的外泌体。与磷酸盐缓冲液(PBS)对照，使用茜素红染色检测其对BMSCs基质矿化，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测成骨分化相关基因Runx2、Osteopontin、Osteocalcin表达的影响。组间比较采用 t检验。 结果:TEM下观察到b-Exo具有典型囊泡样结构，NTA显示b-Exo浓度为7.5×10 10颗粒/ml，直径为(100.0±7.3) nm。b-Exo可显著增强BMSCs基质矿化，b-Exo组成骨分化相关基因核心结合蛋白因子2(Runx2)、骨桥蛋白(Osteopontin)和骨钙蛋白(Osteocalcin)的表达显著高于对照组(8.28±0.34比3.71±0.40， t＝4.974， P<0.01；9.19±1.91比4.09±0.88， t＝5.562， P<0.01；10.31±1.67比5.32±0.31， t＝5.432， P<0.01)，差异均有统计学意义。 结论:bEnd.3细胞来源的外泌体能够促进BMSCs的成骨分化，有望应用于骨再生和骨质疏松症的无细胞治疗。

目的:探讨miR-187-5p通过RANKL/NFκB信号通路对骨质疏松症中破骨细胞活性的影响及机制分析。方法:使用小鼠巨噬细胞264.7细胞株（RAW246.7），设置正常组（con）、核因子κB配体的受体激活子（receptor activator of nuclear factor-κBligand，RANKL）诱导的骨质疏松症组（RANKL-induced OP）、阴性对照（mimic negative control，mimic NC）、OP+miR-187-5p模拟物（OP+miR-187-5p mimic），通过细胞计数试剂盒（the cell counting kit 8，CCK8）检测破骨细胞的增殖水平，RT-qPCR检测TRAPmRNA、miR-187-5p表达水平，免疫印迹检测p65和TNF α蛋白表达。最后，通过双荧光素酶报告基因（dual luciferase reporter assays）检测miR-187-5p和p65间的相互作用。 结果:RAW264.7细胞转染miR-187-5p后，OP组的细胞增殖水平和TRAP mRNA水平显著高于con组（ P=0.008、0.017），OP+miR-187-5p mimic组细胞增殖水平和TRAP mRNA水平显著低于OP+miR-187-5p NC组（ P=0.023、0.037）。而miR-187-5p在OP组显著低于con组（ P=0.031），转染miR-187-5p mimic后升高其表达水平（ P=0.041）。此外，OP组的p65和TNFα蛋白水平明显高于con组（ P=0.034; P=0.024），OP+miR-187-5p mimic组的p65和TNF α蛋白水平显著低于OP+miR-187-5p NC组（ P=0.028； P=0.036）。同时OP组的p65显著高于con组（ P=0.039），OP+miR-187-5p mimic组的p65基因水平明显高于OP+miR-187-5p NC（ P=0.025）。双荧光素酶报告分析，miR-187-5p与p65间存在靶向关系。 结论:miR-187-5p通过抑制NFκB信号通路抑制破骨细胞的活性。

目的:观察微小RNA(miR)-23a-3p通过调控Runx2基因对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响。方法:绝经后骨质疏松症(PMOP)患者及正常的女性志愿者各30例，检测两组血清中miR-23a-3p表达水平。建立雌性小鼠骨质疏松模型后提取BMSCs，将miR-23a-3p inhibitor和miR-阴性对照(NC)分别转染入BMSCs，检测miR-23a-3p表达水平，同时检测成骨基因Runx2、骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)信使RNA(mRNA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测细胞内碱性磷酸酶(ALP)含量。培养HEK293细胞，将miR-23a-3p模拟物和miR-NC分别于野生型Runx2 3’端非编码区(3’UTR)(WT)或突变型Runx2 3’UTR(Mut)重组质粒共转染，使用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。最后将miR-23a-3p inhibitor和miR-23a-3p inhibitor+siRunx2分别转染入BMSCs，检测Runx2蛋白、OCN、Collagen Ⅰ mRNA含量及ALP含量，两样本两组间比较采用 t检验。 结果:PMOP患者血清中miR-23a-3p表达量高于对照组(0.872±0.307比0.382±0.183， t＝7.514， P<0.05)。转染miR-23a-3p inhibitor的BMSCs中miR-23a-3p表达量低于转染miR-NC组(0.480±0.045比1.361±0.113， t＝-16.213， P<0.05)，差异有统计学意义。转染miR-23a-3p inhibitor的BMSCs中Runx2蛋白、OCN、Collagen Ⅰ mRNA表达量及ALP含量高于转染miR-NC组[0.608±0.065比0.234±0.041，0.523±0.053比0.229±0.046，0.652±0.060比0.381±0.030，(5.569±0.377) U/L比(2.513±0.308) U/L， t＝9.409、9.036、10.846、14.036， P<0.05]，差异有统计学意义。生物信息学分析及双荧光素酶报告基因检测进一步证实了Runx2是miR-23a-3p的直接靶点。转染miR-23a-3p inhibitor+siRunx2的BMSCs中Runx2蛋白、OCN、Collagen Ⅰ mRNA表达量及ALP含量低于转染miR-23a-3p inhibitor组[0.373±0.051比0.600±0.083，0.321±0.015比0.645±0.030，0.417±0.027比0.617±0.065，(3.733±0.056) U/L比(6.751±0.091) U/L， t＝5.188、21.491、6.414、63.040， P<0.05]，差异有统计学意义。 结论:miR-23a-3p通过负调控Runx2基因的表达抑制BMSCs成骨分化。

在获得 Bone杂志的授权后，本文对该刊发表于2019年2月的文章[Wu J, Wang A, Wang X, et al. Rapamycin improves bone mass in high-turnover osteoporosis with iron accumulation through positive effects on osteogenesis and angiogenesis. Bone, 2019，121：16-28]进行中文编译。铁蓄积是骨质疏松症的独立危险因素，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在骨形成和血管生成中有着重要的作用。本研究旨在明确mTOR在铁蓄积相关骨质疏松症中的作用及其可能的分子机制，以及雷帕霉素是否能通过靶向mTOR达到有效的治疗效果。构建野生型铁蓄积骨质疏松模型小鼠和转基因(Hepc -/-)铁蓄积骨质疏松模型小鼠，检测体内mTOR水平，体外利用枸橼酸铁铵(FAC)干预成骨细胞，观察mTOR变化，在动物水平采用雷帕霉素干预及在体外细胞水平转染mTOR特异性的siRNA，观察雷帕霉素对铁蓄积骨质疏松模型小鼠骨参数、骨形成和血管生成的影响。结果显示，野生型铁蓄积骨质疏松模型小鼠和Hepc -/-铁蓄积骨质疏松模型小鼠体内的mTOR水平均显著上升，上调的mTOR能够通过激活Cxcl9的表达和分泌，抑制骨组织中"骨形成与血管生成偶联" 。在动物水平采用雷帕霉素干预及在体外细胞水平转染mTOR特异性的siRNA可改善铁蓄积影响的骨形成及骨内血管的生成能力。在成骨细胞中铁蓄积可激活mTOR/STAT1/Cxcl9信号通路，这些结果提示mTOR在铁蓄积骨质疏松症中起关键作用，雷帕霉素能够有效靶向针对mTOR改善骨形成与骨内血管生成，提高伴铁蓄积骨质疏松小鼠的骨量。

目的:铁蓄积与绝经后骨质疏松症发生相关，髋部骨质疏松骨折存在骨髓造血细胞自噬异常；本研究希望了解铁蓄积导致骨量下降与造血细胞自噬功能之间相关性，探索骨质疏松症新的危险因素。方法:使用雄性小鼠腹腔注射枸橼酸铁铵构建铁蓄积小鼠模型，ELISA检测血清铁蛋白和骨生成指标I型前胶原氨基末端肽(P1NP)，micro-CT检测股骨骨密度，通过流式细胞仪分析小鼠股骨和胫骨骨髓造血干祖细胞比例和细胞凋亡，流式成像检测骨髓造血干祖细胞自噬溶酶体形成；使用造血细胞条件性敲除Atg7基因小鼠Atg7 flox/flox; Vav-Cre(本文以Atg7 -/-表示)对Atg7 -/-小鼠股骨进行micro-CT扫描、股骨和胫骨骨髓造血干祖细胞进行转录组测序。 结果:两组比较后铁蓄积组显示：血清铁蛋白升高、血清骨生成指标P1NP表达减低、股骨骨密度下降( P<0.05)，骨髓造血干祖细胞比例异常升高( P<0.05)且伴随细胞凋亡比例增加( P<0.05)，骨髓造血干祖细胞自噬溶酶体形成受抑制；在Atg7 -/-小鼠中，骨髓转录组测序结果提示：铁代谢活动增强，铁载体相关基因Lcn2、膜铁转运相关基因Tfr2，Slc40a1(Fpn1)、Steap3、线粒体亚铁血红素生成通路中酶的调控基因Cpox的mRNA表达均升高，Atg7 -/-小鼠骨量下降( P<0.05)。 结论:铁蓄积导致骨量下降可能与骨髓造血细胞自噬功能抑制相关；骨髓造血细胞自噬异常与骨量下降存在相关性。