[目的]探究枯草芽孢杆菌B579 对黄瓜枯萎病菌的生防效果及诱导抗性机理.[方法]采用平板对峙试验和温室盆栽试验,检测病原菌生长及形态变化、植物生长量、叶片防御酶活性、丙二醛含量、防御相关基因表达量等指标.[结果]枯草芽孢杆菌B579 对黄瓜枯萎病菌具有较强的抑制作用,抑菌圈周围菌丝出现粗细不均、膨胀、断裂等现象.盆栽试验表明B579 对黄瓜枯萎病的防治效果为 78.80%.B579 处理组黄瓜幼苗的株高、茎粗、鲜重、干重分别比对照组增加了 13.87%、4.17%、15.15%、12.77%.相比单独接种病原菌(FOC)处理,接种 B579 再接种病原菌(B579+FOC)处理在第 4 天和第 7 天显著提高了黄瓜叶片苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,并减少黄瓜叶片丙二醛(MDA)的含量(P<0.05).实时荧光定量PCR 检测结果表明,接种 B579 再接种病原菌后,黄瓜叶片防御相关基因LOX、PR1、PR3 和CAT表达量在第 4 天和第 7 天显著高于其他处理(P<0.05).[结论]枯草芽孢杆菌B579 能够通过直接抑制病原菌生长和使黄瓜产生诱导抗性来有效防治黄瓜枯萎病.

尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)引起的枯萎病严重影响黄瓜产业可持续发展,为获得高效拮抗黄瓜枯萎病的芽孢杆菌并明确其促生效果,从具有一定抗性的芽孢杆菌中,筛选出高抗尖镰孢菌的生防菌株,并对其进行形态、生理生化、遗传特性及植株促生特性的评价.结果表明,菌株N1、N3 和N6 抑制尖镰孢菌效果显著,抑菌率分别为77.71%、75.94%、74.76%.鉴定 3 个菌株均为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),且具解钾、分泌蛋白酶、几丁质酶、果胶酶和产铁载体的能力.黄瓜幼苗防病促生盆栽试验表明,接种菌株N1、N3 和N6 病情指数均显著降低,在接种 18 d后防病效果分别为41.93%、20.97%、66.13%.与单一接种病原菌处理相比,N1、N3 和N6 接种显著促进了黄瓜幼苗生长,包括株高、茎粗、叶面积、叶绿素含量、地上和地下部鲜重,其中N6 处理增加效果最显著,分别增加 21.56%、56.13%、47.95%、76.18%、229.89%、70%.与对照相比,处理植株长势特性除地下部鲜重外均显著降低;病原菌接种条件下,添加N6 菌显著增加茎粗和地上部鲜重.N6 可作为防控黄瓜枯萎病、促进幼苗生长有潜力的生物防治资源,用于黄瓜可持续高效生产.

本研究以从中国新疆塔尔巴哈台山上的有毒植物——块根芍药(Paeonia anomala)中分选获得一株产红色素的植物内生菌Serratia marcescens XJU-PA-6为研究对象,首先通过琼脂扩散法将Serratia marcescens XJU-PA-6的发酵获得的色素粗提物分别和11种常见作物病原真菌进行拮抗实验,结果表明,色素粗提物对黄瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌、棉花黄萎病菌、西瓜枯萎病菌和苹果斑点落叶病菌均有较强的抑菌作用,其中对苹果斑点落叶病菌的抑菌作用为最稳定;然后,采用紫外光谱、核磁共振氢谱碳谱分析及GC分析确认XJU-PA-6所产生的红色素为2-甲基-3-戊基灵菌红素(2M3PPG);最后结合扫描电镜、透射电镜和气质联用技术,通过分析发现,2M3PPG可通过抑制苹果斑点落叶病菌中14-α-去甲基化酶活性,来抑制真菌细胞膜上重要成分——麦角固醇的生物合成,从而造成真菌细胞膜中甾醇含量的降低,进而造成细胞膜结构和功能消失,最终导致真菌死亡.本研究结果初步证明,2M3PPG在生物农药方面具有较好地应用潜力.

[背景]黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)黄瓜专化型引起的土传真菌性病害,严重制约着黄瓜产业的发展.[目的]从河西走廊敦煌地区盐碱土壤中分离筛选出一株对黄瓜枯萎病病菌有良好拮抗效果的放线菌菌株,探究其分类地位及其最优发酵条件.[方法]采用稀释平板涂布法分离放线菌,平板对峙法、抑制菌丝生长速率法筛选拮抗菌株,通过培养特征、生理生化试验及16S rRNA基因序列分析确定其分类地位,利用单因素试验和正交试验方法确定其最优发酵配方及培养条件.[结果]菌株16-3-10鉴定为链霉菌属(Streptomyces sp.)菌株,最优发酵配方(g/L):小米10.0,乳糖20.0,蛋白胨1.0,NaCl 5.0,CaCO3 6.0,最优发酵条件:培养温度28℃,装瓶量50/250 mL,培养3d,起始pH 10.0,抑菌率达82.50％,比优化前增加153.43％.[结论]菌株16-3-10对黄瓜枯萎病病菌具有显著的拮抗效果,有较好的应用前景.

[背景]由灰葡萄孢侵染所致的番茄灰霉病是一类重要的真菌病害,生物防治具有环境友好、病原菌不易产生抗药性等特点,是果蔬灰霉病绿色防控的有效措施.[目的]筛选对番茄灰霉病具有防病作用且能促进番茄种子发芽的广谱拮抗性链霉菌,并明确该菌株种级分类地位.[方法]采用琼脂块法筛选拮抗番茄灰霉病菌的链霉菌菌株,采用对峙培养法和生长速率法检测菌株T22抑菌谱,通过产胞外酶活性检测、离体叶片防效和种子发芽试验明确该菌株的防病促生相关特性,根据形态学特征、生理生化特性和分子生物学方法对该菌株进行种类鉴定.[结果]从分离的56株放线菌中筛选到14株对番茄灰霉病菌具有拮抗效果的放线菌菌株,其中链霉菌T22对番茄灰霉病菌抑制作用最强,且具有较广抑菌谱,同时菌株T22具有产生纤维素酶和几丁质酶的能力.菌株T22无菌发酵滤液对番茄灰霉病菌、桃褐腐病菌、黄瓜枯萎病菌抑菌率分别为84.6％、81.5％和79.1％;其无菌发酵滤液原液对番茄灰霉病离体防效为55.1％;100倍稀释液处理番茄种子,胚轴、胚根和种子活力指数分别增加15.1％、29.7％和43.9％.根据形态学特征、生理生化特性和多基因聚类分析将链霉菌T22鉴定为白黑链霉菌(Streptomyces alboniger).[结论]白黑链霉菌T22具有较强的抗真菌、产胞外酶、防病和促生活性,在番茄灰霉病生物防治中具有较好的开发应用潜力.

[背景]科学研究表明,由于南极环境条件特殊,微生物资源丰富,有望筛选出功效显著的抗菌微生物.[目的]以黄瓜枯萎病致病菌木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)为指示菌,从南极沉积物中分离筛选具有拮抗作用的细菌菌株并对其抑菌物质进行初步鉴定.[方法]应用平板对峙法和琼脂扩散法分别对样品和发酵液进行初筛和复筛,筛选出对F.equiseti抑菌效果最强的菌株,基于形态学、生理生化、分子生物学分析,对该菌株进行鉴定.之后,对目标菌株发酵上清中的抑菌物质进行抑菌谱研究,并对其抑菌成分进行温度和pH的稳定性检测,通过硫酸铵沉淀的方法初步鉴定发酵液中的抑菌物质.[结果]从南极沉积物样品中共分离纯化出62株细菌,有5株具有较好的抑菌效果,其中抑菌效果最强的菌株鉴定为枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp, spizizenii),命名为JYM35.抑菌谱检测结果显示,菌株JYM35对丝瓜枯萎病致病菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)和辣椒枯萎病致病菌F.equiseti具有较强的抑菌效果,对长豆褐腐病致病菌笄霉属(Choanephora)有较明显的拮抗作用,对水产致病菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)也有一定的拮抗作用.菌株JYM35发酵上清中所含的抑菌物质热稳定性强且耐碱不耐酸,硫酸铵沉淀后可初步确定其抑菌物质隶属蛋白类.[结论]菌株JYM35是一株产蛋白类活性物质的广谱型抑菌菌株,对枯萎病致病菌的拮抗作用最强.因此具有较好的开发利用价值.

利用真菌作为诱导菌株评价其对龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)MY02的活性代谢产物的影响,并对其诱导条件进行优化.当以康宁木霉(Trichoderma koningii)和香菇真菌(Lentinus edodes)作为诱导菌株,黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f sp.cucumarinum)作为指示菌,以菌株MY02作为被诱导菌株时,康宁木霉和香菇真菌对菌株MY02的抗真菌活性均具有明显的正向诱导作用,菌株MY02的抗真菌活性均比对照明显增强.以康宁木霉作为诱导菌株时,其最佳诱导条件为接种量2％,添加时间为发酵36 h.通过初步分析康宁木霉的诱导组分为其发酵产生的多糖类物质.

从蚯蚓粪中筛选出一株能抑制尖镰孢黄瓜专化型枯萎病菌的拮抗菌株,并通过优化培养条件以提高抑菌能力.以尖镰孢黄瓜专化型枯萎病菌为供试病原菌,以蚯蚓粪为供试材料,通过平板稀释法和平板对峙法中筛选到一株能较好抑制尖镰孢黄瓜专化型枯萎病菌的菌株WQ-5,通过形态学观察、生理生化特征和16S rRNA序列分析,初步鉴定其种属.通过单因素和响应面分析法对该菌的培养条件进行优化.通过防效试验验证其防效.菌株WQ-5为解淀粉芽孢杆菌,其最适培养条件为果糖30 g/L,酵母粉18.9 g/L,硫酸镁3 g/L,甘油1 g/L,磷酸氢二钾1.5 g/L,pH 5.8,装液量38.6％,转速240 r/min,接种量5％和温度30℃.优化后对黄瓜枯萎病菌的抑菌直径和抑菌率较优化前分别提高了24.8％和30.39％.防效试验表明,菌株WQ-5使种子发病率降低了20％,发芽率提高了150％,种子的根长、茎长和活力指数显著提高,植株病情指数下降了48.65％,防治效果为51.67％.菌株WQ-5对黄瓜枯萎病菌有较好防效,具有潜在的研究和应用价值.

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是RNA病毒基因组功能研究的重要模式种,其各个开放阅读框及顺式作用元件的功能已较为清楚,但还缺乏RNA3基因间隔区的功能在植物体水平上的相关研究.本研究采用基因合成和双酶切的方法构建了基因间隔区(Intergenic region,IGR) 3'UTR、5'UTR和全序列的缺失突变体侵染性克隆(简称p△3'UTR,p△5'UTR和p△All),并结合农杆菌介导的瞬时表达分析了IGR的功能.接种结果显示,注射p△3'UTR侵染性克隆的本氏烟表现出与注射野生型(Wild type,Wt)的本氏烟相似的症状,但要比Wt晚3.5d,而注射p△5'UTR、p△All的本氏烟没有表现任何症状,直至枯萎.Western Blot结果显示,注射突变体的本氏烟中,只有注射p△3'UTR的本氏烟在出现症状后可被检测到外壳蛋白(Coat protein,CP),但远低于Wt中的CP表达量,说明IGR 3'UTR缺失使最终翻译出来的外壳蛋白水平明显降低;Northern Blot结果显示,也只有注射p△3'UTR的本氏烟在出现症状后表达了RNA3和RNA4,但表达量始终低于野生型.针对接种叶内RNA3的半定量RT-PCR结果显示,注射Wt、p△3'UTR的本氏烟的预期条带亮度都很高,说明RNA3在缺失IGR 3'端序列时仍能正常转录且能正常复制;而注射p△5'UTR、p△All的本氏烟的预期条带亮度都很低,说明RNA3在缺失IGR 5'端序列或缺失IGR全部序列时,cDNA仍能转录出少量的RNA3,但这些RNA3完全丧失了复制能力.本研究揭示IGR5'UTR含有RNA3复制的必要元件,其缺失将使病毒完全失去复制能力;IGR 3'UTR控制着RNA3复制的效率,其缺失导致RNA3的积累量显著降低;IGR 3'UTR缺失时病毒只翻译出少量的CP,但也使寄主产生严重的症状.

产紫篮状菌Q2菌株是一株分离自健康黄瓜根际的有益微生物.本文通过平皿对峙培养、温室盆栽试验和田间试验评估了Q2菌株对4种土传病害的生防潜力及其与土壤熏蒸技术结合对苦瓜枯萎病的防治效果,并通过平皿稀释培养法、高通量技术和定量PCR技术对其防治苦瓜枯萎病及调控土壤微生物群落的机制进行研究.结果 表明:在温室条件下,Q2菌株对苦瓜枯萎病、烟草黑胫病、烟草根黑腐病和马铃薯茎基腐病具有明显的预防效果,对烟草黑胫病和苦瓜枯萎病防治效果分别达到75.3％和63.4％.在苦瓜枯萎病人工病圃中,单一产紫篮状菌Q2制剂对苦瓜枯萎病的防治效果为51.0％,其结合威百亩土壤熏蒸技术在相同试验条件下对枯萎病的防治效果则达到80％以上.威百亩土壤熏蒸显著降低了土壤中苦瓜枯萎病病原菌即尖镰孢菌的丰度,而Q2菌株有效地抑制了尖镰孢菌数量的恢复趋势.施用Q2菌株显著富集了土壤中的青霉菌、芽孢杆菌和Gaiella等有益微生物,抑制了尖镰孢菌的恢复.土壤熏蒸后,施用产紫篮状菌Q2菌株有助于土壤有益微生物菌群的形成,从而抑制尖镰孢菌,实现对苦瓜枯萎病的防治.