[目的]探究枯草芽孢杆菌B579 对黄瓜枯萎病菌的生防效果及诱导抗性机理.[方法]采用平板对峙试验和温室盆栽试验,检测病原菌生长及形态变化、植物生长量、叶片防御酶活性、丙二醛含量、防御相关基因表达量等指标.[结果]枯草芽孢杆菌B579 对黄瓜枯萎病菌具有较强的抑制作用,抑菌圈周围菌丝出现粗细不均、膨胀、断裂等现象.盆栽试验表明B579 对黄瓜枯萎病的防治效果为 78.80%.B579 处理组黄瓜幼苗的株高、茎粗、鲜重、干重分别比对照组增加了 13.87%、4.17%、15.15%、12.77%.相比单独接种病原菌(FOC)处理,接种 B579 再接种病原菌(B579+FOC)处理在第 4 天和第 7 天显著提高了黄瓜叶片苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,并减少黄瓜叶片丙二醛(MDA)的含量(P<0.05).实时荧光定量PCR 检测结果表明,接种 B579 再接种病原菌后,黄瓜叶片防御相关基因LOX、PR1、PR3 和CAT表达量在第 4 天和第 7 天显著高于其他处理(P<0.05).[结论]枯草芽孢杆菌B579 能够通过直接抑制病原菌生长和使黄瓜产生诱导抗性来有效防治黄瓜枯萎病.

本研究以从中国新疆塔尔巴哈台山上的有毒植物——块根芍药(Paeonia anomala)中分选获得一株产红色素的植物内生菌Serratia marcescens XJU-PA-6为研究对象,首先通过琼脂扩散法将Serratia marcescens XJU-PA-6的发酵获得的色素粗提物分别和11种常见作物病原真菌进行拮抗实验,结果表明,色素粗提物对黄瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌、棉花黄萎病菌、西瓜枯萎病菌和苹果斑点落叶病菌均有较强的抑菌作用,其中对苹果斑点落叶病菌的抑菌作用为最稳定;然后,采用紫外光谱、核磁共振氢谱碳谱分析及GC分析确认XJU-PA-6所产生的红色素为2-甲基-3-戊基灵菌红素(2M3PPG);最后结合扫描电镜、透射电镜和气质联用技术,通过分析发现,2M3PPG可通过抑制苹果斑点落叶病菌中14-α-去甲基化酶活性,来抑制真菌细胞膜上重要成分——麦角固醇的生物合成,从而造成真菌细胞膜中甾醇含量的降低,进而造成细胞膜结构和功能消失,最终导致真菌死亡.本研究结果初步证明,2M3PPG在生物农药方面具有较好地应用潜力.

[背景]黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)黄瓜专化型引起的土传真菌性病害,严重制约着黄瓜产业的发展.[目的]从河西走廊敦煌地区盐碱土壤中分离筛选出一株对黄瓜枯萎病病菌有良好拮抗效果的放线菌菌株,探究其分类地位及其最优发酵条件.[方法]采用稀释平板涂布法分离放线菌,平板对峙法、抑制菌丝生长速率法筛选拮抗菌株,通过培养特征、生理生化试验及16S rRNA基因序列分析确定其分类地位,利用单因素试验和正交试验方法确定其最优发酵配方及培养条件.[结果]菌株16-3-10鉴定为链霉菌属(Streptomyces sp.)菌株,最优发酵配方(g/L):小米10.0,乳糖20.0,蛋白胨1.0,NaCl 5.0,CaCO3 6.0,最优发酵条件:培养温度28℃,装瓶量50/250 mL,培养3d,起始pH 10.0,抑菌率达82.50％,比优化前增加153.43％.[结论]菌株16-3-10对黄瓜枯萎病病菌具有显著的拮抗效果,有较好的应用前景.

[背景]由灰葡萄孢侵染所致的番茄灰霉病是一类重要的真菌病害,生物防治具有环境友好、病原菌不易产生抗药性等特点,是果蔬灰霉病绿色防控的有效措施.[目的]筛选对番茄灰霉病具有防病作用且能促进番茄种子发芽的广谱拮抗性链霉菌,并明确该菌株种级分类地位.[方法]采用琼脂块法筛选拮抗番茄灰霉病菌的链霉菌菌株,采用对峙培养法和生长速率法检测菌株T22抑菌谱,通过产胞外酶活性检测、离体叶片防效和种子发芽试验明确该菌株的防病促生相关特性,根据形态学特征、生理生化特性和分子生物学方法对该菌株进行种类鉴定.[结果]从分离的56株放线菌中筛选到14株对番茄灰霉病菌具有拮抗效果的放线菌菌株,其中链霉菌T22对番茄灰霉病菌抑制作用最强,且具有较广抑菌谱,同时菌株T22具有产生纤维素酶和几丁质酶的能力.菌株T22无菌发酵滤液对番茄灰霉病菌、桃褐腐病菌、黄瓜枯萎病菌抑菌率分别为84.6％、81.5％和79.1％;其无菌发酵滤液原液对番茄灰霉病离体防效为55.1％;100倍稀释液处理番茄种子,胚轴、胚根和种子活力指数分别增加15.1％、29.7％和43.9％.根据形态学特征、生理生化特性和多基因聚类分析将链霉菌T22鉴定为白黑链霉菌(Streptomyces alboniger).[结论]白黑链霉菌T22具有较强的抗真菌、产胞外酶、防病和促生活性,在番茄灰霉病生物防治中具有较好的开发应用潜力.

[背景]科学研究表明,由于南极环境条件特殊,微生物资源丰富,有望筛选出功效显著的抗菌微生物.[目的]以黄瓜枯萎病致病菌木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)为指示菌,从南极沉积物中分离筛选具有拮抗作用的细菌菌株并对其抑菌物质进行初步鉴定.[方法]应用平板对峙法和琼脂扩散法分别对样品和发酵液进行初筛和复筛,筛选出对F.equiseti抑菌效果最强的菌株,基于形态学、生理生化、分子生物学分析,对该菌株进行鉴定.之后,对目标菌株发酵上清中的抑菌物质进行抑菌谱研究,并对其抑菌成分进行温度和pH的稳定性检测,通过硫酸铵沉淀的方法初步鉴定发酵液中的抑菌物质.[结果]从南极沉积物样品中共分离纯化出62株细菌,有5株具有较好的抑菌效果,其中抑菌效果最强的菌株鉴定为枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp, spizizenii),命名为JYM35.抑菌谱检测结果显示,菌株JYM35对丝瓜枯萎病致病菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)和辣椒枯萎病致病菌F.equiseti具有较强的抑菌效果,对长豆褐腐病致病菌笄霉属(Choanephora)有较明显的拮抗作用,对水产致病菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)也有一定的拮抗作用.菌株JYM35发酵上清中所含的抑菌物质热稳定性强且耐碱不耐酸,硫酸铵沉淀后可初步确定其抑菌物质隶属蛋白类.[结论]菌株JYM35是一株产蛋白类活性物质的广谱型抑菌菌株,对枯萎病致病菌的拮抗作用最强.因此具有较好的开发利用价值.

利用真菌作为诱导菌株评价其对龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)MY02的活性代谢产物的影响,并对其诱导条件进行优化.当以康宁木霉(Trichoderma koningii)和香菇真菌(Lentinus edodes)作为诱导菌株,黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f sp.cucumarinum)作为指示菌,以菌株MY02作为被诱导菌株时,康宁木霉和香菇真菌对菌株MY02的抗真菌活性均具有明显的正向诱导作用,菌株MY02的抗真菌活性均比对照明显增强.以康宁木霉作为诱导菌株时,其最佳诱导条件为接种量2％,添加时间为发酵36 h.通过初步分析康宁木霉的诱导组分为其发酵产生的多糖类物质.

从蚯蚓粪中筛选出一株能抑制尖镰孢黄瓜专化型枯萎病菌的拮抗菌株,并通过优化培养条件以提高抑菌能力.以尖镰孢黄瓜专化型枯萎病菌为供试病原菌,以蚯蚓粪为供试材料,通过平板稀释法和平板对峙法中筛选到一株能较好抑制尖镰孢黄瓜专化型枯萎病菌的菌株WQ-5,通过形态学观察、生理生化特征和16S rRNA序列分析,初步鉴定其种属.通过单因素和响应面分析法对该菌的培养条件进行优化.通过防效试验验证其防效.菌株WQ-5为解淀粉芽孢杆菌,其最适培养条件为果糖30 g/L,酵母粉18.9 g/L,硫酸镁3 g/L,甘油1 g/L,磷酸氢二钾1.5 g/L,pH 5.8,装液量38.6％,转速240 r/min,接种量5％和温度30℃.优化后对黄瓜枯萎病菌的抑菌直径和抑菌率较优化前分别提高了24.8％和30.39％.防效试验表明,菌株WQ-5使种子发病率降低了20％,发芽率提高了150％,种子的根长、茎长和活力指数显著提高,植株病情指数下降了48.65％,防治效果为51.67％.菌株WQ-5对黄瓜枯萎病菌有较好防效,具有潜在的研究和应用价值.

为明确微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)G-1发酵液抗真菌特性和较优发酵条件,本研究采用平板对峙法、生长速率法、单因素试验、RDA分析和响应面CCD设计分别对其抗真菌特性、产抗菌物质关键限制因子和发酵条件较优组合进行了探究.结果 表明:S.albidoflavus G-1发酵液对马铃薯早疫病菌、西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、辣椒枯萎病菌、黄瓜疫霉病菌和桃褐腐病菌具有较好抑菌效果,抑菌率均可达70％;发酵液在≤80℃、紫外照射24h、pH 3-13和稀释100倍条件下仍可保持70％以上抑菌率;产抗菌物质关键限制因子为初始pH值、温度、麦芽糖和马铃薯;较优发酵条件为8％麦芽糖、马铃薯16.5％、初始pH 6.5、温度30℃、转速160 r/min、发酵5d,且在该条件下可使抑菌率提高14.46％.说明菌株G-1发酵液具有良好的抑真菌稳定性,且优化后的发酵条件可使菌株G-1在较低成本和较短时间内产生大量抗菌物质,研究结果为其后期田间应用和规模化发酵奠定了理论基础.

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)是云南特有的具有高抗枯萎病遗传性状的瓜类种质资源.为鉴定黑籽南瓜中NBS-LRR类基因的抗病功能,该研究从其叶片中克隆了NBS类基因CfRFN2(GenBank ID:MK618462),测序全长为4303 bp,完整的编码框长度为4092 bp,编码1363个氨基酸残基,该基因注释为拟南芥抗病蛋白At4g27190类转录体X1的同源基因,含有1个NB-ARC和2个LRR结构域,属于具有信号肽的可溶性蛋白.核苷酸相似性分析显示,CfRFN2与其他瓜类NBS类基因相似性在87％～98％之间;系统进化树分析表明,CfRFN2蛋白和瓜类的其他NBS类抗病蛋白聚为一个分支,其中CfRFN2蛋白与中国南瓜和美洲南瓜的RPS2、印度南瓜的RPS2-like亲缘关系最近,其次是黄瓜的At4g27190和苦瓜的At4g27220,与甜瓜的Atg27190亲缘关系相对较远;组织表达特性分析表明,CfRFN2基因在黑籽南瓜叶片中表达量最高,其次是茎,而在果皮和根中表达量较低.该研究采用烟草脆裂病毒载体系统,构建了黑籽南瓜VIGS沉默载体pTRV2-CfRFN2,含沉默载体的农杆菌侵染黑籽南瓜幼苗后接种枯萎病菌,qRT-PCR检测表明,接种后2 d和4 d的转pTRV2-CfRFN2沉默组植株的CfR-FN2基因表达量比接种后同时期的野生型植株显著降低(分别下降34.75％和98.27％),病情指数增加为野生型的1.32倍,初步证明黑籽南瓜CfRFN2基因具有抗枯萎病的功能,推测该基因可能在黑籽南瓜抗枯萎病防御过程中发挥着重要作用.该研究中NBS类基因CfRFN2的克隆和VIGS验证为黑籽南瓜更多优异基因的克隆和功能验证奠定了前期基础,也为发掘黑籽南瓜优异抗病基因和开展瓜类分子育种提供新信息.

植物内生菌具有增强宿主植物抵抗生物和非生物胁迫的能力,也具有增强宿主植物对磷、钾等矿质元素的分解吸收,进而促进植物的生长.本文采用平板对峙法检测亳菊内生菌BN7对玉米弯孢病菌、黄瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、串珠镰刀病菌、瓜炭疽病菌、茶叶轮斑病菌等6种植物病原菌的拮抗作用;测定菌株BN7的解磷、解钾、产生长素、降解纤维素能力和对DPPH的清除能力;并根据菌株形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析对菌株BN7进行鉴定.结果 表明:亳菊内生菌BN7对小麦赤霉菌等6种植物病原菌均有抑制作用;菌株BN7使有机磷和无机磷发酵液中可溶性磷分别增加了108.38和68.71 mg/L,使可溶性钾增加了32.03 mg/L,IAA的分泌量高达164.39 mg/L;培养3天菌株BN7羧甲基纤维素酶和滤纸酶的活力达到最高,分别为168.78和79.87 U/mL;培养7天的上清液对DPPH清除率可达82.13％;根据形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析,菌株BN7初步鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium).因此,亳菊内生菌BN7是一株具有广谱抗真菌、解磷、解钾、产IAA和降解纤维素能力的巨大芽孢杆菌.