[目的]从松材线虫的媒介天牛蛹室及其气管中获得的黏质沙雷氏菌Serratia marcescens AHPC29对松材线虫具有致病能力,本研究旨在探究黏质沙雷氏菌AHPC29 对松材线虫引起的松树萎蔫病的防治效果以及该菌株在实验室的增菌条件.[方法]通过对温室内人工感染松材线虫的松树灌溉菌剂,分析黏质沙雷氏菌AHPC29 对松树萎蔫病的作用效果;通过单组分筛选和正交实验确定培养基组分和培养条件对其生长的影响,探究黏质沙雷氏菌AHPC29 的最佳增菌条件.[结果]对于感染松材线虫的松树,灌溉黏质沙雷氏菌AHPC29 菌液的处理组生长状态优于对照组,并且树内松材线虫含量显著降低;黏质沙雷氏菌AHPC29 增菌的最佳培养基配比为 0.1%乳糖、0.5%复合氨基酸、0.5%KNO3、1.5%MgSO4,其中影响最大的组分为氮源;培养时其菌液最佳接种量为 7%,最佳装液量为40%,最佳转速为180 r·min-1,最佳温度为30℃,最适培养时长为36 h.[结论]本研究获得了黏质沙雷氏菌AHPC29 的最佳增菌条件,并证实该菌具有良好的松树萎蔫病防治应用潜力,为其作为生防菌的应用提供了理论基础.

目的 调查分析海南省某高校大学生使用中的滴眼液微生物污染情况,为日常滴眼液的正确使用提供理论参考依据.方法 收集2022年3～5月海南医学院大学生正在使用中的滴眼液101瓶,对其微生物进行分离纯化和培养,并利用全自动快速微生物质谱检测系统鉴定感染菌种.采用χ2检验和二元Logistic回归模型,从滴眼液污染的不同部位、使用者的特征、滴眼液的类型、购买渠道和是否规范使用等方面进行对比,分析滴眼液污染的独立危险因素.结果 101瓶滴眼液样本中共分离培养出22种条件致病菌,表皮葡萄球菌和黏质沙雷氏菌是最常见的细菌性污染;滴眼液瓶口(26.73%)、瓶身(26.73%)的污染率高于残余液体(7.92%),差异有统计学意义(P<0.05);滴眼液污染率在开封时间、类型、购买渠道和规范使用方面差异均有统计学意义(P<0.05),而在滴眼液使用者的性别、年龄和教育水平方面比较差异均无统计学意义(P>0.05);经二元Logistic回归分析结果显示,购买渠道、是否规范使用以及滴眼液的类型是滴眼液污染的独立影响因素(P<0.05).结论 该高校在校学生所使用中的滴眼液微生物污染较为严重,滴眼液瓶的瓶口、瓶身及残余液体均存在污染情况,有引发眼部感染的潜在风险,需在生活中加强滴眼液的规范使用.

磷脂酶A1是一类水解磷脂的酶类,利用生物信息学方法对磷脂酶A1基因及辅助蛋白基因进行分析,为进一步研究磷脂酶提供基础.通过对黏质沙雷氏菌plaA(Phospholipase A1)及plaS(accessory protein)进行克隆和测序,对其核苷酸序列和氨基酸序列特征进行分析;对其蛋白质二级结构、三级结构进行了预测;同时运用ML、MP和BI 3种方法构建了系统发育树.结果表明,plaS的dN/dS的值较plaA高,所受的选择压力较小,进化速率较快;PlaA蛋白和PlaS蛋白的二级结构都以α螺旋和无规则卷曲为主;plaA与plaS联合构建的系统发育树支持率较16S单独构建的支持率高.基于plaA、plaS和16S 3个基因联合构建的系统发育树中,解脲沙雷氏菌和嗜线虫沙雷氏菌都与黏质沙雷氏菌聚为一支,在亲缘关系上,这两种沙雷氏菌可能跟黏质沙雷氏菌更为接近.

目的:对一株产鸟氨酸的钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYPA5-5/ΔproB/ΔargF(SYPO-1)进行代谢工程改造,筛选不同细菌来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶在大肠杆菌中克隆与表达,纯化后对其进行酶学性质的比较;将黏质沙雷氏菌Serr atia marcescens Y213来源的SmargE基因编码的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶在L-鸟氨酸生产菌株C.crenatum SYPO-1中过量表达,进一步提高L-鸟氨酸的产量.方法:通过利用pDXW10穿梭质粒对不同来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰化酶进行克隆表达和酶学性质比较,选择性质最优来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶编码基因SmargE在产L-鸟氨酸重组钝齿棒杆菌中表达,考察重组菌株发酵过程中参数的变化.结果:来源于S.marcescens Y213的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶比酶活最高为798.98U/mg,最适pH为7,最适温度为37C,0.1 mmol/L的Mg2+、Li+、Mn2+促进酶的比酶活提高了50％;在钝齿棒杆菌中表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶酶活达到128.4U/ml,显著提高了钝齿棒杆菌中胞内乙酰基循环水平;5L发酵罐发酵重组菌株96h,L-鸟氨酸的产量达到38.5g/L,比出发菌株,L-鸟氨酸的产量提高了33.2％,产率达0.401g/(L·h).结论:筛选出最佳来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶,在鸟氨酸生产菌株C.crenatum(SYPO-1)中过量表达,可以促进鸟氨酸的前体物质N-乙酰鸟氨酸的快速消耗,实现鸟氨酸的积累.

本研究对分离自重庆垫江稻田土壤的一株产红色色素细菌进行了形态学和16S rRNA序列鉴定,测定红色素最大紫外吸收波长,并对其稳定性进行研究.结果显示,该菌与多株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)16S rRNA序列一致;产生的色素在541 nm处有最大紫外吸收峰,与灵菌红素最大吸收峰接近,初步推测其为灵菌红素或其衍生物;该红色素在pH 6～11性质稳定;紫外光照射稳定性差,耐氧化能力较强,与还原剂产生沉淀;金属阳离子对该色素有不同程度的消色作用,Cu2+消色作用最明显,遇SO42-离子产生沉淀.

目的:对美洲大蠊内生黏质沙雷氏菌几丁质酶ChiA基因进行克隆、可溶性表达及功能验证.方法:PCR扩增ChiA基因,TA亚克隆,构建重组表达载体ChiA/pET21b,生物信息学分析和低温诱导表达、SDS-PAGE、Western blot鉴定,打孔法对几丁质酶活性检测.结果:PCR成功扩增了ChiA基因序列,该序列与GenBank上的S.marcescens ChiA基因序列同源性达99％;该序列编码571个氨基酸,并能够在原核系统中稳定表达.可溶性表达分析显示:通过低温诱导表达,获得可溶性的目的蛋白;活性试验发现:含目的蛋白的表达产物可分解几丁质,且活性强于美洲大蠊内生黏质沙雷氏菌.结论:从美洲大蠊内生黏质沙雷氏菌基因组中成功克隆了几丁质酶ChiA基因,通过原核表达系统获得了具有较强活性的可溶性几丁质酶ChiA,为其应用奠定了基础.

目的 了解我国儿童人群中碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)分布及耐药现状,为临床合理使用抗菌药物提供依据.方法 收集2016年1月1日至2017年12月31日国内10所三级甲等儿童医院的临床分离株,采用纸片扩散法(KB法)和仪器法对CRE菌株进行药敏试验,根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)2017年版标准判断结果.采用WHONET 5.6统计分析软件对菌株分布特点和耐药性进行回顾性分析.结果 共收集3065株CRE临床分离株,总体检出率为7.7％,新生儿组检出率(13.5％)较非新生儿组(5.8％)高,2017年CRE检出率较2016年呈上升趋势(9.7％vs 5.7％).3065株CRE分离株前5位分别是肺炎克雷伯菌1912株(62.0％)、大肠埃希菌667株(22.0％)、阴沟肠杆菌206株(7.0％)、产气克雷氏菌(56株,1.8％)、黏质沙雷菌(47株,1.5％).主要分布科室为新生儿科[含新生儿重症监护室(NICU),44.8％]、重症监护室(ICU,19.7％).呼吸道标本(61.8％)、尿液标本(19.4％)、血液标本(5.7％)是CRE分离株的主要来源.药敏结果显示,CRE菌株对亚胺培南、美罗培南、厄他培南等碳青霉烯类抗菌药物以及青霉素类、大多数头孢菌素类呈高度耐药(79.6％ ～100％),其中新生儿组耐药程度更高(P<0.05),另外儿童对阿米卡星(19.7％)、磷霉素(11.9％)等氨基糖苷类,左氧氟沙星(37.7％)、环丙沙星(43.3％)等氟喹诺酮类,替加环素(3.8％)等耐药率相对较低,目前未分离到多黏菌素B耐药株.结论 2017年CRE常见菌种检出率较2016年均有不同程度的上升,新生儿较其他儿童检出率更高,且对临床常见抗菌药物耐药形势更为严峻,应引起高度重视并及时采取措施.

目的 探讨呼吸机相关性肺炎(VAP)患者碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)感染的分子流行病学特征及影响因素.方法 选择非重复CRE感染的VAP患者58例(CRE感染组)、同期非CRE感染VAP患者116例(对照组).用DL-96细菌测定系统鉴定CRE,MIC法进行药物敏感试验与结果判断,用改良碳青霉烯灭活实验(mCIM)和四乙酸碳碳青霉烯类失活法(eCIM)检测碳青霉烯酶表型,用PCR法检测CRE耐药基因,用单因素及多因素非条件Logistic回归分析CRE感染的影响因素.结果 CRE感染组检出58株病原菌,感染患者多分布于ICU、神经外科及呼吸内科等;58株CRE中最常见的为肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌,所有分离的菌株对多黏菌素均高度敏感,对米诺环素、复方新诺明和阿米卡星等抗生素也具有较高的的敏感性;58株CRE仅mCIM阳性23株,mCIM与eCIM均阳性30株;肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌及产酸克雷伯菌均检测出不同种类的耐药基因,弗氏柠檬酸杆菌、黏质沙雷氏菌未检测出耐药基因.入住ICU＞7 d(OR=3.431,95％ CI 1.251 ～4.152)、含β-内酰胺酶抑制剂抗生素使用(OR=3.018,95％ CI1.102～5.394)、碳青霉烯类抗生素使用(OR =5.232,95％ CI2.579～7.561)是VAP患者CRE医院感染的独立危险因素.结论 VAP患者CRE医院感染的主要耐药基因为KPC-2和NDM-1;入住ICU＞7 d及使用含β-内酰胺酶抑制剂抗生素、碳青霉烯类抗生素的VAP患者易感染CRE.

目的 开发微生物发酵生产舍雷肽酶的工艺,并了解基本酶学特性.方法 从家蚕蛹的肠道中分离产酶菌株,单因素实验和响应面实验优化发酵培养基,采用(NH4)2S04沉淀、超滤和DEAE离子交换层析3步纯化舍雷肽酶,电泳法测定酶的相对分子质量和等电点,考察pH和温度对酶活力和稳定性的影响,并测算酶的反应动力学常数.结果 分离获得一株产舍雷肽酶的黏质沙雷氏菌LL-413菌株,摇瓶发酵产酶活力达到1 126 U?mL-1,10-L发酵罐中发酵产酶活性达到1 505 U?mL-1;舍雷肽酶相对分子质量和等电点分别约为52×103和7.2;酶活最适pH为8.0,在pH 5.0～10.0之间稳定;酶活最适温度为40℃,在45℃以下稳定.以酪蛋白为底物时,米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)分别为22.3 mg?mL-1和1 355 mg?L?min-1.结论 利用黏质沙雷氏菌LL-413菌株生产舍雷肽酶发酵单位高,酶的蛋白水解能力强、pH和热稳定性好,研究结果为该酶的生产和应用奠定了基础.

[目的]了解散白蚁头部发红且死亡的原因,探究致病菌特性.[方法]从头部发红的散白蚁中分离菌株、培养并纯化,通过显微形态、革兰氏染色及16S rRNA基因序列分析鉴定菌株种类.进一步探究菌株产生红色素的条件并通过液相色谱和质谱联用等方法鉴定发酵产物.[结果]散白蚁鉴定为栖北散白蚁Reticulitermes speratus.从该白蚁头部分离得到一株产红色素的革兰氏阴性细菌RS.16S rDNA序列分析表明RS菌株为黏质沙雷氏菌Serratiamarcescens.RS菌株不同于其它大多黏质沙雷氏菌,在37℃仍然产生红色素.HPLC检测分析红色素为灵菌红素.[结论]本文首次报道从栖北散白蚁分离纯化一株产生灵菌红素的黏质沙雷氏RS菌,研究结果为灵菌红素的生产及散白蚁生物防治技术的研发提供了新的思路.