目的:基于下一代测序技术（NGS）检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆循环游离DNA（cfDNA）突变的性能验证，评估NGS、微滴式数字PCR（ddPCR）和超级扩增阻滞突变系统（super-ARMS）在NSCLC患者中的应用。方法:入组75例于复旦大学附属中山医院呼吸科就诊的NSCLC患者。采用NGS检测标准品、25例初诊未治疗患者的血浆cfDNA、以及血浆中掺入血红蛋白（0.5 mg）、胆红素（0.5 mg）、脂肪乳（0.5 mg）、肠球菌基因组DNA（gDNA）和大肠埃希菌gDNA的自制混合标本，以验证NGS平台的空白限、分析灵敏度、精密度、准确性及分析特异性。采用ddPCR和NGS检测75例NSCLC患者的cfDNA突变，比较两平台的突变阳性率，采用Pearson相关性检验比较两平台对于cfDNA突变丰度之间的线性关系。在75例患者中采用简单随机抽样法抽取12例进行血浆super-ARMS平台的检测，比较NGS、ddPCR与super-ARMS的检测一致性。结果:NGS平台对血浆cfDNA突变检测的空白限为0.00%；敏感度为0.2%；批内精密度、批间精密度均为100%；准确性为100%；检测结果不受血浆内源性血红蛋白、胆红素、甘油三酯或外源性DNA干扰影响，分析特异性好。75例NSCLC患者血浆cfDNA 的ddPCR平台和NGS平台的突变阳性率分别为61.33%、60.00%，完全一致率为89.33%。NGS与ddPCR均检测出突变的51个位点的突变丰度呈正相关（ r=0.984， P=0.001）。在简单随机抽样法抽取的12例NSCLC患者血浆中，NGS、ddPCR与super-ARMS三平台检测结果完全一致的共7例，包括2例野生型，5例突变型。 结论:NGS平台经验证可用于NSCLC患者cfDNA突变检测，ddPCR、NGS、super-ARMS对血浆cfDNA的突变检测各有优势。

目的 探讨灵菌红素对创面分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑菌效果和作用机制.方法 选取2021年至2022年嘉兴市第一医院分离培养的64株创面组织感染MRSA菌株,采用微量肉汤稀释法测定单用灵菌红素及与左氧氟沙星联合作用时的最低抑菌浓度(MIC),计算部分抑菌指数评价联合抑菌效果;并通过透射电镜观察灵菌红素对MRSA菌株的抑菌作用.结果 灵菌红素对MRSA菌株的50％MIC为0.5 mg/L,90％MIC为1.0 mg/L;与左氧氟沙星联用时1株(1.54％)结果为协同作用,30株(46.15％)结果为相加作用;透射电镜观察到灵菌红素对MRSA菌株细胞膜结构完整性破坏作用明显.结论 灵菌红素通过破坏细菌胞膜达到对MRSA菌株的抑菌作用,与左氧氟沙星联合使用时具有一定的协同或相加作用.

灵菌红素是一种天然的红色三吡咯色素,主要源自于微生物的次级代谢过程,其具有抗菌、抗肿瘤等功能,在医药、环境、染料等领域具有广阔的应用前景.随着合成生物学技术的不断发展,利用微生物发酵法合成灵菌红素是实现灵菌红素工业化生产的有效途径之一.目前,生产灵菌红素的微生物主要以粘质沙雷氏菌为主.本文系统介绍了灵菌红素的结构性质和应用潜力,重点阐述了粘质沙雷氏菌中灵菌红素的合成路径,总结了通过高产菌株选育与改造、发酵工艺优化和转录因子调控等策略提高灵菌红素合成的最新研究进展,分析了不同提取纯化工艺的效率,并对未来灵菌红素的高效合成进行了展望,以进一步提高灵菌红素的工业化生产效率.

目的 采用快速分子诊断方法中TaqMan荧光定量PCR技术,应用于利福平和异烟肼一线抗结核药物耐药基因的诊断中,评价其性能,建立高灵敏度、高特异度、高准确性并且快速的筛查方法,为结核分枝杆菌耐药性的诊断和治疗提供依据并探讨其应用价值,努力改善耐药结核病的检测和可行性.方法 本研究针对利福平ropB基因531位点突变和异烟肼katG基因315位点突变的特点,设计TaqMan-MGB引物和探针,通过反应条件优化,建立TaqMan荧光定量PCR方法;用克隆到pUC57载体上的阳性标准品及不同菌株评价该方法的特异性、灵敏度、重复性和精密度,采用甘油三酯、胆红素和血红素进行了干扰性实验.结果 TaqMan荧光定量PCR方法的检测限可达10copies/μl;在交叉干扰实验中,检测了 5种常见呼吸道感染细菌国家标准菌株,均未检出,基因野生型和突变型探针特异性较好,不受其它基因干扰;批内、批间的CT值变异系数均小于5％,标准曲线R2=0.998,扩增效率均在90％以上;该反应迅速,检测时间为1h.结论 本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法有助于及时发现结核分枝杆菌耐药情况,对结核病的耐药检测与后续治疗具有重要意义.

目的 分析肝硬化腹水患者并发自发性细菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis,SBP)的危险因素,并探讨血小板-白蛋白-胆红素(platelet-albumin-bilirubin,PALBI)评分联合腹水多形核细胞百分比(polymorphonuclear percentage,PMN%)对肝硬化并发 SBP 的预测价值.方法 选取 2018 年 1 月至 2022 年 1 月于徐州医科大学附属医院确诊为肝硬化腹水患者 242 例,SBP 组67 例,非 SBP 组 175 例.收集患者的一般资料、合并症及实验室指标.通过多因素二元 Logistic 回归模型筛选出独立危险因素,绘制 ROC曲线获得最佳临界值并评估其预测价值.结果 非 SBP 组的腹水 ALB 显著高于 SBP 组(P＜0.05),血 NEUT%、血 WBC、INR、TBil、PT、腹水 PMN%、腹水 WBC、PALBI评分、白蛋白-胆红素(albumin-bilirubin,ALBI)评分、Child-Pugh评分、终末期肝病模型(model for end-stage liver disease,MELD)均明显低于 SBP 组(P＜0.05);两组是否伴有肝肾综合征、肝性脑病比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).多因素二元 Logistic回归分析表明,PALBI 评分、PMN%是其独立危险因素(P＜0.05).ROC 曲线表明,PALBI 评分、腹水 PMN%及两者联合诊断 SBP 的曲线下面积分别为 0.740、0.839 和 0.918;灵敏度分别为 68.7%、70.1%和 85.1%;特异度分别为 73.7%、85.1%和 86.2%.结论 PALBI评分联合腹水 PMN%对肝硬化腹水患者发生 SBP 具有较高的预测价值.

目的 分析替诺福韦酯联合复方益肝灵片对肺结核合并乙型肝炎病毒(HBV)携带患者免疫功能及肝肾功能的影响.方法 前瞻性选取2019年1月至2020年12月在秦皇岛市第二医院就诊的180例肺结核合并HBV感染患者作为研究对象,按照随机数字表法将其分为研究组和对照组,每组90例.对照组患者给予2HRZE/4HR常规化疗,同时采用葡醛内酯等进行常规保肝治疗,研究组患者在对照组治疗方案基础上加用口服富马酸替诺福韦二吡呋酯胶囊和复方益肝灵片.两组患者均连续治疗6个月,在治疗期间连续监测肝肾功能指标.对两组患者治疗6个月末时的病灶吸收和痰菌转阴比例进行比较;对两组患者治疗前和治疗6个月末时的HBV病毒载量、外周血CD4+T淋巴细胞比例、CD8+T淋巴细胞比例、CD4+/CD8+T淋巴细胞比值及血清肝功能指标[丙氨酸转移酶(ALT)、天冬氨酸转移酶(AST)、总胆红素]和肾功能指标(肌酐、尿素氮)水平进行比较;对两组患者治疗期间肝功能损害发生率及程度和肾功能损害发生率进行记录和比较.结果 治疗6个月末,研究组患者病灶吸收、痰菌转阴的比例均高于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).研究组患者的HBV载量较治疗前下降,对照组患者的HBV载量较治疗前上升,研究组患者治疗6个月末的HBV载量低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).研究组患者的外周血CD4+T淋巴细胞比例和CD4+/CD8+T淋巴细胞比值均较治疗前升高,CD8+T淋巴细胞比例较治疗前下降,差异均有统计学意义(P＜0.05),而对照组患者外周血T淋巴细胞亚群指标与治疗前比较,差异均无统计学意义(P＞0.05),研究组患者治疗6个月末的外周血CD4+T淋巴细胞比例和CD4+/CD8+T淋巴细胞比值均高于对照组,CD8+T淋巴细胞比例低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).两组患者的肝功能指标和肾功能指标均较治疗前升高,研究组患者治疗6个月末的ALT、AST、总胆红素、肌酐、尿素氮均低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).在治疗期间,研究组患者的肝功能损害和肾功能损害的发生率均低于对照组,肝功能损害程度分布低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在肺结核合并HBV感染患者的治疗中,在常规抗结核化疗和保肝治疗基础上采用替诺福韦酯联合复方益肝灵片进行辅助治疗,能够显著提升化疗效果、有效降低HBV载量、调节免疫平衡、保护肝肾功能、减少化疗导致的药物性器官损害.

探讨脉络舒通丸对大鼠股骨骨折引起的后肢肿胀的保护作用及其潜在机制.将大鼠随机分为假手术组、模型组、脉络舒通丸(MLST)低剂量组(1.8 g·kg-1·d-1)、MLST高剂量组(3.6 g·kg-1·d-1)和阳性药组(迈之灵片 60 mg·kg-1·d-1).假手术组暴露股骨后缝合伤口,其余 4 组均进行机械性损伤造成股骨骨折,于造模前 7 d及造模后 5 d对各给药组给予灌胃给药,假手术组、模型组给予等剂量蒸馏水灌胃.采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色检测大鼠后肢肌肉组织的病理损伤,并测量其后肢肿胀度.酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测各组大鼠血清中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平,以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性.蛋白免疫印记(Western blot)技术检测大鼠后肢肌肉组织中血红素氧合酶 1(heme oxygenase 1,HO-1)、醌氧化还原酶NADH 1[NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1]、核转录因子E2 相关因子 2(nuclear transcription factor E2-related factor 2,Nrf2)蛋白表达水平.通过 16S rDNA测序和超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测大鼠肠道菌群及肠道代谢物的变化进而挖掘出MLST治疗大鼠股骨骨折引起的后肢肿胀的潜在机制.与模型组相比,MLST可明显改善大鼠后肢肿胀程度;降低血清炎性因子水平;减轻氧化应激损伤.HE染色结果表明,MLST组大鼠后肢肌肉组织中炎性浸润情况显著改善.Western blot结果显示,与模型组相比,MLST可显著升高大鼠后肢肌肉组织中HO-1、NQO1、Nrf2 蛋白表达.16S rDNA测序结果表明,MLST可以改善股骨骨折后大鼠肠道菌群的紊乱;UPLC-MS/MS结果表明,MLST显著影响股骨骨折后大鼠肠道中胆汁酸生物合成代谢通路,并且Spearman分析证实参与胆汁酸生物合成的代谢物deoxycholic acid与Turicibacter丰度呈显著正相关;代谢物cholic acid与Papilibacter、Staphylococcus、Intestinimonas呈显著正相关;代谢物lithocholic acid与Papilibacter、Intestinimonas呈显著正相关.以上结果表明MLST能够保护大鼠股骨骨折引起的后肢肿胀,这种保护作用可能是通过改善后肢肌肉病理损伤,降低血清中炎症和氧化应激相关因子的表达水平,减少后肢肌肉氧化损伤,改善肠道菌群和平衡肠道内胆汁酸生物合成实现的.

目的 研究灵菌红素对鼻咽癌细胞CNE-2的增殖、周期、凋亡的影响.方法 以鼻咽癌细胞CNE-2为研究对象,体外采用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术和DAPI染色分别检测灵菌红素对鼻咽癌细胞CNE-2的增殖、周期及凋亡的影响.结果 灵菌红素可以抑制鼻咽癌细胞CNE-2的增殖,且与时间和浓度呈依赖性,其中24μg/mL的灵菌红素处理CNE-2细胞24 h后的抑制率高达94.5％.灵菌红素改变鼻咽癌细胞CNE-2的周期分布,使细胞周期阻滞在G2期,并诱导CNE-2细胞发生凋亡,且与作用浓度以及时间呈依赖关系.浓度为8μg/mL的灵菌红素处理24 h,G2期比例达23.93％,处理72 h,凋亡率达16.24％,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 灵菌红素对鼻咽癌CNE-2细胞具有抑制增殖、改变周期分布和诱导凋亡的作用.

目的 探讨血清CRP与PCT联合检测对新生儿细菌感染的诊断价值及指导抗菌药物合理使用的临床意义.方法 选取2015年6月-2016年12月期间于医院就诊的细菌感染性疾病患儿58例作为研究对象,根据细菌培养结果分为感染组40例,重症感染组18例,同期选取18例单纯高胆红素血症的新生儿作为对照组,比较三组新生儿的一般临床资料、血清CRP和PCT的含量,确定CRP和PCT对新生儿细菌感染的曲线下面积和诊断分界点,统计新生儿细菌感染的灵敏度、特异性、阳性与阴性的预测值,并对新生儿临床使用抗菌药物情况进行调查分析.结果 三组新生儿在入院24 h内CRP和PCT水平比较差异有统计学意义(P＜0.05),以重症感染组的指标水平最高;治疗72 h后,三组新生儿的指标水平数值均有所下降,其中重症感染组下降较明显,CRP和PCT对新生儿细菌感染均具有诊断价值,其中CRP诊断灵敏度为66.67％,特异性为72.5％;PCT的诊断灵敏度为55.56％、特异性为87.5％;重症感染组住院治疗的平均时间为(15.00±4.50)d,明显长于感染组(11.35±3.2)d;重症感染组新生儿接受抗菌药物治疗时间明显长于感染组新生儿,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 CRP与PCT检测对新生儿细菌感染性疾病具有早期诊断价值,根据检测结果早期应用抗菌药物,能够有效控制感染,预防病情的发展,可以推荐作为临床诊断和治疗的评价方法.

天然色素化合物灵菌红素具有抑制细菌、真菌、疟疾、藻类和肿瘤细胞等多种生物学活性;微生物发酵是生产灵菌红素的主要方法.从自然界植物根际土壤中分离得到一株产红色色素的菌株JWR.经形态和16S rDNA测序鉴定,菌株JWR为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens);用酸性甲醇溶液对发酵液萃取得到灵菌红素的粗提物,利用FT-IR和HPLC鉴定产物,证明该菌株所产红色色素为灵菌红素.通过单因素以及正交优化法对发酵培养基组分和发酵条件进行优化,确定发酵培养基配方为橄榄油1.5 mL/L、牛肉膏0.5 g/L、硫酸镁0.25 g/L,发酵条件为接种量2.5％(V/V)、温度28℃、转速220 r/min.优化后灵菌红素产量提高到6.011 g/L,相比优化前提高了2.845倍.本研究分离粘质沙雷氏菌并优化发酵条件,提高了灵菌红素产量,可为其工业化生产奠定基础.