为建立云南红豆杉(Taxus yunnanensis)中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)和紫杉醇(Taxol)的分析方法,该研究采用基质固相萃取-高效液相色谱分析(MSPD-HPLC)对云南红豆杉中的 10-DAB Ⅲ及Taxol进行定量分析,探究硅胶、佛罗里硅土、酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝、C18、C18-ME、C18-G1、C18-HC、Diol、Xamide、Xion共12 种样品预处理分散剂及各种分散剂的质量、洗脱剂的种类、洗脱剂的浓度、洗脱剂体积对两种成分分析的影响,并对优化后的条件进行方法学验证,同时与超声提取、热回流提取预处理方法进行比较分析证明其有效性.结果表明:(1)12 种固相分散剂中,碱性氧化铝具有良好的目标化合物萃取物检出量,并且当碱性氧化铝与样品的质量比为 3∶1、6mL甲醇为洗脱剂洗脱时,10-DAB Ⅲ和Taxol的萃取检出量较高.(2)建立的云南红豆杉枝叶中 10-DAB Ⅲ和 Taxol 的分析方法具有良好的线性关系(r≥0.999 9),10-DAB Ⅲ和Taxol的检出限和定量限分别介于 0.023 9～0.030 1 μg·mL-1和 0.142～0.178 μg·mL-1之间;各目标分析物平均加样回收率在 93.6%～109.0%之间.(3)比较分析显示,3 种方法对 2 种紫杉烷类化合物的萃取检出量基本无差别,但MSPD法溶剂消耗少、操作简单,分析时间短,净化效率高,可应用于云南红豆杉原料的快速分析.该研究以碱性氧化铝为分散剂应用于云南红豆杉紫杉烷类化合物的萃取,建立了快速、高效的云南红豆杉中10-DABⅢ和紫杉醇的分析方法,为云南红豆杉中的紫杉烷类化合物的定量分析提供了依据.

目的 研究曼地亚红豆杉Taxus media枝叶的化学成分.方法 通过硅胶、凝胶Sephadex LH-20、ODS等色谱方法分离纯化,运用1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS等多种波谱技术鉴定化合物结构.结果 从曼地亚红豆杉乙醇提取物的石油醚、醋酸乙酯萃取部位分离鉴定出18个化合物,包括8个紫杉烷二萜类化合物:taxinine-11,12-oxide(1)、9α,10β-二乙酰基-2α-羟基-5α-桂皮酰基-3,11-环化紫杉烷-4(20)-烯-13-酮(2)、2-去乙酰氧基紫杉宁E(3)、7,9-二去乙酰基紫杉宁B(4)、紫杉吉酚(5)、9-去乙酰基紫杉宁A(6)、9-去乙酰基紫杉宁(7)、10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ (8);5个黄酮类化合物:山柰酚(9)、香橙素(10)、芹菜素(11)、金松双黄酮(12)、银杏双黄酮(13);3个酚酸类化合物:对羟基苯甲醛(14)、对羟基苯甲酸(15)、邻苯二酚(16);以及β-谷甾醇(17)、正二十烷-10-醇(18).结论 化合物18为首次从红豆杉科植物中发现,化合物1～4、6、7、10、14～16为首次从曼地亚红豆杉中分离得到.

目的 利用迭代饱和突变技术进一步提高 10-去乙酰巴卡亭 Ⅲ-10-β-O-乙酰转移酶双突变体 DBATG38R/F301V的活性;通过丙氨酸扫描确定 DBAT 活性中心的重要位点.方法 利用迭代饱和突变技术在现有双突变体DBATG38R/F301V的基础上对 Ser396进行半饱和突变,筛选对10-去乙酰紫杉醇(DT)催化活性提高的突变体;对获得的高活性突变体蛋白进行催化 DT 的最适温度和最适 pH 测定;在最适 pH 条件下,将其分别用最适反应温度和 0 ℃温育 6 h,考察该蛋白的热稳定性;采用生物信息学方法分析活性提高的分子机制.对 DBAT 底物结合区域尚未进行分析的几个氨基酸进行丙氨酸扫描研究,分析这些位点在DBAT 催化 10-DAB 和 DT 过程中的作用.结果 获得了三突变体 DBATG38R/F301V/S396I,其催化 DT 的活性为 DBATG38R/F301V的 1.6 倍,该蛋白催化 DT 的最适条件为 37.5 ℃,pH 7.5;该蛋白在 37.5 ℃ 静置 6 h 后催化 DT 的活力为初始值的 30%,在 0 ℃ 静置 6 h 后为初始值的 70%;丙氨酸扫描结果显示,Asn45在 DBAT 催化10-DAB 和 DT 时都非常重要,而 Asn42、Glu350、Glu355和Lys389位点对催化 10-DAB 的影响更大.结论 将活性口袋内的亲水性氨基酸向疏水性氨基酸突变可能有利于 DBAT 对 DT 的催化,但氨基酸侧链的长度和空间构型也是影响催化活性的重要因素;发现 Asn45可能是一个潜在的 DBAT 催化或底物结合位点.

目的:测定南方红豆杉不同组织器官紫杉烷类物质的含量,优选出最佳采收部位,为其开发利用提供依据.方法:分别采集南方红豆杉植株主干树皮、侧皮、根皮、须根、茎、叶六个组织器官材料,运用HPLC法检测紫杉烷类物质含量,确定其最佳利用组织器官.结果:南方红豆杉四种紫杉烷类在组织中的分布明显地受组织分化的影响,其中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ在叶中最多,7-表-10-去乙酰基紫杉醇在侧皮中最多,紫杉醇、三尖杉宁碱则在根中最多.结论:叶是合成紫杉醇前体物质的主要器官,而皮与根则是合成及积累紫杉醇的主要组织器官.

目的 分析和比较5种红豆杉中6种紫杉烷类化合物含量的差异.方法 利用乙醇超声浸提后得到样品溶液;通过高效液相色谱法测定和相关性分析、回归分析和聚类分析比较紫杉醇、巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-deacetylbaccatinⅢ,10-DAB)、10-去乙酰基紫杉醇(10-deacetyltaxol,10-DAT)、三尖杉宁碱和10-去乙酰基-7-木糖基紫杉醇(10-deacetyl-7-xylosetaxol,DXT)含量.结果 不同种红豆杉紫杉烷含量存在显著性差异,陇南地区中国红豆杉中10-DAB、紫杉醇、10-DAT和三尖杉宁碱含量显著高于其他种红豆杉,曼地亚红豆杉和湖南省南方红豆杉中10-DAB含量也相对较高;相关性分析、回归分析及聚类分析均表明,10-DAT和三尖杉宁碱与紫杉醇含量显著相关,且前者比后者对紫杉醇含量的影响作用更大;聚类分析还表明温室内栽植的南方红豆杉聚为一类,大田种植的中国红豆杉、东北红豆杉、太行山地区南方红豆杉和曼地亚红豆杉聚为一类,表明环境因子对紫杉烷积累具有明显影响.结论 不同种红豆杉中紫杉烷含量具有显著差异,种类是影响红豆杉紫杉醇等紫杉烷含量的重要因素,紫杉醇含量随着10-DAT和三尖杉宁碱含量增加而增加.

旨在筛选美洲大蠊肠道具有产7-木糖紫杉烷糖基水解酶性能的内生菌,并对其进行生物学鉴定.以实验室保存的178株美洲大蠊肠道内生菌为研究对象,采用刚果红透明圈法和荧光显色法筛选产木聚糖酶菌株,进一步利用薄层色谱法筛选产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株.在此基础上,选取一株高产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定,并采用高效液相色谱法测定其对7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的转化率.结果显示,178株美洲大蠊肠道内生菌中有55株菌产木聚糖酶,其中8株链霉菌和2株贪铜菌可产生7-木糖紫杉烷糖基水解酶.高产菌株WA11-2-9经形态学特征、生理生化试验和16S rDNA序列分析鉴定为Streptomyces enissocaesilis.WA11-2-9可将7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇转化为10-去乙酰巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰紫杉醇,主要产物10-去乙酰紫杉醇的转化率为21.52％.美洲大蠊肠道内生菌WA 11-2-9(GenBank Accession:MZ411692)具有分泌7-木糖紫杉烷糖基水解酶的能力,它为后续生物转化制备紫杉醇奠定了坚实基础.

通过测定低温胁迫下红豆杉电阻抗参数和紫杉烷含量变化,确定适合红豆杉低温半致死温度测定的电阻抗参数,探讨低温对红豆杉紫杉烷生物合成的影响,为扩大红豆杉引种范围及利用低温条件提高红豆杉中紫杉醇含量奠定了理论基础.以云南红豆杉、南方红豆杉(山西长治)、中国红豆杉、曼地亚红豆杉和东北红豆杉为材料,分别采用电导率法和电阻抗法测定上述树种低温半致死温度,并利用LC-MS法测定低温胁迫下红豆杉叶片中紫杉烷含量和脱落酸(abscisic acid,ABA)含量.结果表明,5 种红豆杉中,中国红豆杉、南方红豆杉(山西长治)、东北红豆杉和曼地亚红豆杉均能耐受-14.668--9.106℃低温;云南红豆杉能耐受-8.802--3.521℃低温,高于其他 4 种红豆杉.电阻抗τm参数与电导法测定的 5 种红豆杉一年生枝低温半致死温度显著相关,相关系数为 0.912.低温胁迫下,红豆杉一年生叶片中紫杉醇含量高于当年生叶片.随着处理温度的下降,云南红豆杉和东北红豆杉一年生叶片中紫杉醇含量显著增加,中国红豆杉当年生叶片中巴卡亭Ⅲ含量和 10-去乙酰基紫杉醇含量显著增加.此外,红豆杉叶片中ABA含量随温度的下降而增加,当年生叶片中ABA含量高于一年生叶片.与云南红豆杉相比,东北红豆杉、曼地亚红豆杉、南方红豆杉(山西长治)和中国红豆杉能耐受更低的温度.低温有利于云南红豆杉和东北红豆杉一年生叶片中紫杉醇的合成及中国红豆杉当年叶片中巴卡亭Ⅲ和 10-去乙酰基紫杉醇的合成.