目的 建立曼地亚红豆杉Taxus×media曲指纹图谱,对曼地亚红豆杉曲质量控制和资源开发提供科学依据.方法 采用HPLC法建立 45 批曼地亚红豆杉曲的指纹图谱,通过对照品比对,对共有峰进行指认,确定并建立 7 种有效成分含量的测定方法.在指纹图谱基础上,结合聚类分析、主成分分析及正交偏最小二乘法-判别分析等筛选出不同发酵程度曼地亚红豆杉曲间差异性标志物.结果 45 批曼地亚红豆杉共有32 个共有峰,指认了 18 种成分,相似度均大于 0.9.通过聚类分析将不同发酵程度曼地亚红豆杉曲分为5类,主成分分析提取了4个主成分;综合分析筛选10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、紫杉醇、7-表紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮作为曼地亚红豆杉曲的质控成分,质量分数范围分别为0.071 5～0.123 7、0.124 5～0.117 1、0.113 5～0.126 1、0.122 5～0.162 7、0.071 0～0.089 3、0.809 1～1.110 2、1.003 1～1.994 8 mg/g.结论 建立的指纹图谱及多成分含量测定方法专属性强,稳定,可靠,为曼地亚红豆杉曲的质量控制及资源开发提供参考.

目的 基于赤霉素(gibberellin A3,GA3)处理下的南方红豆杉Taxus chinensis var.mairei转录组数据鉴定和分析SSR位点,开发可用于南方红豆杉种质资源鉴定和遗传多样性分析的SSR标记.方法 使用MISA软件对南方红豆杉转录组数据进行SSR分析,搜索SSR位点.可搜索单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸,最小重复数分别设置为10、6、5、5、5、5次.采用Primer 3(2.3.5版,默认参数)进行SSR引物设计.通过毛细管荧光电泳检测,最终选定多态性好,扩增成功率高的SSR引物用于后续数据分析;通过MEGA进行UPGMA聚类分析,构建聚类树.结果 转录组测序共获得202 361条Unigene,采用MISA软件搜索出12 008个SSR位点,分布在10 894条Unigenes上,发生频率为5.38％,平均距离为1/7.64 kb.单核苷酸重复类型最丰富,占总SSR位点的51.74％,其次为三核苷酸(20.92％)和二核苷酸重复类型(20.88％).A/T、AG/CT是优势重复基序,分别占总SSR重复类型的49.60％和10.93％.随机抽选96对SSR引物,以4个地区12份南方红豆杉种质进行引物有效性和多态性验证,筛选出13对具多态性的SSR引物,多态性引物比率为13.54％.13对引物在东北红豆杉Taxus cuspidata扩增效率高达100％,但在曼地亚红豆杉Taxus × media扩增效率仅为23.08％.聚类分析表明太行山地区南方红豆杉聚为一类,浙江、福建和湖南等南方来源的南方红豆杉聚为一类,后三者彼此之间遗传距离更近.结论 南方红豆杉转录组测序产生的Unigene信息可以用来开发SSR分子标记,开发的13个标记将有助于南方红豆杉物种遗传多样性、分子育种、资源保护等方面的研究.

目的 分析和比较5个不同产地、不同生长年限曼地亚红豆杉中3种紫杉烷类活性成分量的差异.方法 利用甲醇和三氯甲烷混合液超声浸提后再用甲醇溶解得到样品溶液;通过高效液相色谱法测定和比较10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB Ⅲ)、三尖杉宁碱和紫杉醇量及3者总量.结果 不同产地、不同生长年限的曼地亚红豆杉中3种紫杉烷类及其总量间存在极显著性差异(P＜0.01);10-DAB Ⅲ、三尖杉宁碱、紫杉醇和3种紫杉烷类总量相对较高的3个产地及生长年限分别依次为HK4＞ SM3＞ SM2、ZL3＞ HK4＞ ZL4、ZL3＞ SM2＞ HK4、HK4＞ ZL3＞ ZL6.除10-DAB Ⅲ与三尖杉宁碱量间不存在显著的相关性外,其余各成分间均存在极显著的正相关关系(P＜0.01);不同产地及生长年限间紫杉醇与3种紫杉烷类总量间呈现出同升同降的趋势;聚类分析表明福建福州产区紫杉醇量具有一定的特殊性,而河南开封3种紫杉烷类总量有别于其他产区.结论 产地和生长年限对曼地亚红豆杉中3种紫杉烷类量的变化具有明显的影响,可以通过对生物合成途径进行调控,继而达到获得更多紫杉醇原料药的目的.

目的:分析和比较海南和四川不同生长年限曼地亚红豆杉3种紫杉烷类活性成分的的含量差异.方法:利用甲醇和CHC13混合液超声浸提后再用甲醇溶解得到相关成分;通过高效液相色谱法对10-DABⅢ、三尖杉宁碱和紫杉醇含量进行测定和比较.结果:1)不同生长年限,海南栽培曼地亚红豆杉3年生枝条中10-DABⅢ和紫杉醇含量均最高,7年生枝条中三尖杉宁碱含量最高;四川栽培曼地亚红豆杉4年生枝条中10-DABⅢ和三尖杉宁碱含量均最高,紫杉醇含量在不同生长年限间不存在显著性差异(P＞0.05).2)相同生长年限,四川栽培曼地亚红豆杉10-DABⅢ含量普遍高于海南栽培曼地亚红豆杉,三尖杉宁碱含量两个产地间有高有低,海南栽培3年生曼地亚红豆杉紫杉醇含量在所有年限间最高.结论:四川栽培曼地亚红豆杉10-DABⅢ含量高于海南栽培曼地亚红豆杉,可以优先作为10-DABⅢ提取的材料来源产地;海南栽培4年生和3年生曼地亚红豆杉分别作为三尖杉宁碱和紫杉醇粗提原料来源更优.

为丰富产紫杉醇植物内生真菌资源库,从曼地亚红豆杉Taxus media茎中分离得到一株产紫杉醇的内生真菌TMS-26.通过对TMS-26的发酵提取物进行高效液相色谱分析,发现其具有与紫杉醇标准品(4.545 min)相近的色谱特征峰.进一步通过液质联用仪检测发现,内生真菌TMS-26的发酵提取物中具有与紫杉醇标准品((M+Na)+=876)相近的质谱特征峰,表明内生真菌TMS-26能够产生紫杉醇.同时通过传统形态学分类鉴定方法和18S rDNA序列分析、Internal-transcribed spacer (ITS)序列分析等现代分子生物学分类鉴定方法,最终将内生真菌TMS-26鉴定为曲霉属烟曲霉Aspergillus fumigatus,并命名为“烟曲霉TMS-26”.

目的 研究曼地亚红豆杉Taxus media枝叶的化学成分.方法 通过硅胶、凝胶Sephadex LH-20、ODS等色谱方法分离纯化,运用1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS等多种波谱技术鉴定化合物结构.结果 从曼地亚红豆杉乙醇提取物的石油醚、醋酸乙酯萃取部位分离鉴定出18个化合物,包括8个紫杉烷二萜类化合物:taxinine-11,12-oxide(1)、9α,10β-二乙酰基-2α-羟基-5α-桂皮酰基-3,11-环化紫杉烷-4(20)-烯-13-酮(2)、2-去乙酰氧基紫杉宁E(3)、7,9-二去乙酰基紫杉宁B(4)、紫杉吉酚(5)、9-去乙酰基紫杉宁A(6)、9-去乙酰基紫杉宁(7)、10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ (8);5个黄酮类化合物:山柰酚(9)、香橙素(10)、芹菜素(11)、金松双黄酮(12)、银杏双黄酮(13);3个酚酸类化合物:对羟基苯甲醛(14)、对羟基苯甲酸(15)、邻苯二酚(16);以及β-谷甾醇(17)、正二十烷-10-醇(18).结论 化合物18为首次从红豆杉科植物中发现,化合物1～4、6、7、10、14～16为首次从曼地亚红豆杉中分离得到.

目的 建立红豆杉枝叶中紫杉醇的含量测定方法,并测定湖北钟祥地区不同品种红豆杉中紫杉醇的全年含量变化,为红豆杉枝叶的最佳采收期提供依据,同时为红豆杉品种选育及可持续开发利用提供参考.方法 采用ZORBAX Eclipse plus C18(4.6×250mm,5μm)色谱柱,以甲醇-乙腈-水(27-25-48)为流动相,检测波长227nm,柱温为35℃,流速为1.00mL/min,选样量为10μL,理论塔板数不低于2500.结果 曼地亚红豆杉希克莎、曼地亚红豆杉紫科一号、曼地亚红豆杉绿星、曼地亚红豆杉泰斗、曼地亚红豆杉红建、南方红豆杉六种红豆杉枝叶中紫杉醇全年含量最高的月份分别为8月,8月,5月,9月,10月,5月.结论 该测定方法简便、准确、重现性好,可用于红豆杉枝叶中紫杉醇含量的定量测定;曼地亚红豆杉紫科一号枝叶中紫杉醇的含量最高.

目的 分析和比较5种红豆杉中6种紫杉烷类化合物含量的差异.方法 利用乙醇超声浸提后得到样品溶液;通过高效液相色谱法测定和相关性分析、回归分析和聚类分析比较紫杉醇、巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-deacetylbaccatinⅢ,10-DAB)、10-去乙酰基紫杉醇(10-deacetyltaxol,10-DAT)、三尖杉宁碱和10-去乙酰基-7-木糖基紫杉醇(10-deacetyl-7-xylosetaxol,DXT)含量.结果 不同种红豆杉紫杉烷含量存在显著性差异,陇南地区中国红豆杉中10-DAB、紫杉醇、10-DAT和三尖杉宁碱含量显著高于其他种红豆杉,曼地亚红豆杉和湖南省南方红豆杉中10-DAB含量也相对较高;相关性分析、回归分析及聚类分析均表明,10-DAT和三尖杉宁碱与紫杉醇含量显著相关,且前者比后者对紫杉醇含量的影响作用更大;聚类分析还表明温室内栽植的南方红豆杉聚为一类,大田种植的中国红豆杉、东北红豆杉、太行山地区南方红豆杉和曼地亚红豆杉聚为一类,表明环境因子对紫杉烷积累具有明显影响.结论 不同种红豆杉中紫杉烷含量具有显著差异,种类是影响红豆杉紫杉醇等紫杉烷含量的重要因素,紫杉醇含量随着10-DAT和三尖杉宁碱含量增加而增加.

为研究红豆杉紫杉醇合成途径限速酶基因功能及其对内生真菌烟曲霉TMS-26发酵产紫杉醇的影响,以曼地亚红豆杉愈伤组织制备cDNA作为模板扩增苯丙氨酸氨基变位酶基因(Txpam),构建重组质粒pGEX-4T-1-Txpam,转入大肠杆菌中进行异源诱导表达,经亲和层析纯化,获取重组酶TxPAM并验证其酶活性.构建pCAMBIA1302-Txpam质粒,转化农杆菌感受态细胞,利用农杆菌介导的转化体系获得转化子并优化转化条件,结合插入片段携带的分子标记和目的 基因进行转化子验证,同时培养转化菌株并检测紫杉醇产量.结果 表明:纯化获取的重组酶TxPAM,经HPLC检测具有将α-苯丙氨酸催化为β-苯丙氨酸的功能;在最优转化条件下,转化子数目达到471个/106个孢子;根据基因hyg和Txpam的克隆以及测序结果,说明成功构建了基因工程菌株,通过对其发酵条件进行优化,紫杉醇产量达到721.87μg/L.

红豆杉属植物由于天然生长缓慢、繁育能力衰退和种群竞争力弱等客观因素以及人为过度开发利用和生境破坏等主观因素已濒临灭绝,因此对其种质资源的繁育保护已成为当前研究的热点.本研究以我国特有的3种红豆杉(东北红豆杉、南方红豆杉和曼地亚红豆杉)为研究对象,选取带有腋芽的茎段组织为外植体,系统考察了不同植物激素组合对于腋芽的启动、增殖及生根的影响,最终确定了 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA为腋芽启动培养基,MS+0.4 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 NAA为不定芽增殖培养基,发现3种红豆杉在上述培养基中都能够有效启动和增殖;同时,优化确定了 WPM+0.8 mg·L-1 NAA+0.2 mg·L-1 IBA培养基可促使东北红豆杉不定芽生根,且不添加任何植物激素的WPM培养基有利于生根苗的后续生长.本研究建立了一种简单有效的红豆杉体外繁育方法,为我国红豆杉资源的保护和可持续利用提供了有力的技术支持.