目的:探讨MassARRAY技术在希特林蛋白缺乏症二阶段分子筛查中的应用价值，了解两种筛查方法下新生儿希特林蛋白缺乏症的检出率、临床特征、基因突变特点及随访结果。方法:单独通过串联质技术对181 459例新生儿进行瓜氨酸(citrulline，Cit)浓度检测；通过串联质技术对33 156例新生儿检测瓜氨酸浓度，把瓜氨酸浓度截断值大于90百分位(Cit>20 μmol/L)，且小于99.5百分位(Cit<43 μmol/L)2 506例进一步应用MassARRAY技术进行二阶段SLC25A13基因筛查，并对阳性患儿进行系统治疗随访。结果:确诊的4例患儿均来自同一地区，单独串联质谱方法确诊2例，串联质谱方法结合MassARRAY技术确诊2例。4例患者中3例检出SLC25A13基因复合杂合突变，1例只检测出一个SLC25A13基因突变；2 506例检出36例携带者，携带率1/70。单独通过串联质技术筛查检出率1/90 729，二阶段分子筛查检出率1/1 253。结论:淄博市希特林蛋白缺乏症总体发病率较高，MassARRAY技术可以提高串联质谱技术筛查产生假阴性聚集性地区的检出率，早诊断、早治疗，预后好。

目的:原核表达GII.P16型诺如病毒RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）蛋白，并对其进行生物活性测定和晶体制备。方法:首先通过RT-PCR方法获得GII.P16 RdRp完整基因并将其克隆至携带His-Tag PET28a载体，构建重组表达质粒，然后转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，并用IPTG诱导RdRp的表达，最后利用SDS-PAGE和Western blot的方法鉴定蛋白的表达情况；采用His-Tag亲和层析和分子筛的方法纯化目的蛋白；分别使用体外酶催化实验和Hampton结晶试剂盒进行蛋白活性测定和晶体筛选。结果:构建了原核表达重组体PET28a-RdRp，并大量表达了相对分子质量约60 kDa的可溶性蛋白；经两次纯化后，获得了高纯度的目的蛋白，纯度达到90%以上；体外酶催化实验显示RdRp重组蛋白具有良好的生物活性；通过多种生长条件的筛选，获得了优质的RdRp晶体。结论:本研究成功获得的GII.P16 RdRp蛋白及其晶体，为理解其生物学功能和解析其晶体结构奠定了基础。

目的:建立尿中1-甲氧基-2-丙醇（1-methoxy-2-propanol，1M2P）的顶空固相微萃取-气相色谱测定方法。方法:采用碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（CAR/PDMS）涂层固相微萃取头对尿样进行顶空萃取；单因素轮换法对萃取温度、盐析量、萃取时间进行优化；以DB-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm）毛细管柱为分离柱，氢火焰离子化检测器（FID）检测，外标法定量。结果:尿中1M2P浓度在0.50~10.0 mg/L线性关系良好，相关系数为0.999 3，方法检出限为0.14 mg/L，定量下限为0.45 mg/L，回收率为85.8%~104.7%，日内精密度为3.25%~6.65%，日间精密度为0.81%~3.96%。结论:该方法灵敏度高，操作简便，适用于职业暴露1M2P人群尿中1M2P的测定。

目的:克隆幽门螺杆菌(Hp)hp0169基因并进行晶体学研究,分析其二级结构和三维结构.方法:由UniProt数据库中检索Hp NCTC26695菌株hp0169基因及其编码蛋白序列,采用生物信息学方法分析Hp重组胶原蛋白酶(HpPrtC)蛋白理化性质,SOPMA和DNAStrar软件预测HpPrtC蛋白二级结构特征,SWISS-MOPEL软件构建HpPrtC蛋白三维结构,IEDB和ABCpred软件预测HpPrtC蛋白B淋巴细胞抗原表位,SYFPEITHI网站预测T淋巴细胞抗原表位,专家库(EP)算法和随机森林(RF)算法预测HpPrtC蛋白可结晶性.原核表达HpPrtC重组蛋白,经Ni2+亲和层析和分子筛技术纯化蛋白,结晶试剂盒筛选HpPrtC的结晶条件.结果:hp0169基因共包含1 269个碱基配对,编码蛋白全长422个氨基酸,理论等电点为7.64,相对分子质量为47 300.HpPrtC蛋白为亲水性、可溶性蛋白.HpPrtC蛋白α螺旋的氨基酸数量占全部氨基酸数量百分率为35.78%,β片层为18.72%,β转角为 6.87%,无规则卷曲为 38.63%.抗原表位分析,HpPrtC蛋白含有B淋巴细胞的 5个优势线性表位和 3个构象表位及多个T淋巴细胞潜在优势抗原表位.同源建模,HpPrtC蛋白呈二聚体,单体由β折叠围成桶状结构,周围被α螺旋和无规则卷曲围绕.HpPrtC蛋白为中等难度结晶,且无信号肽和跨膜螺旋,在 0.2 mol·L-1 氯化镁、0.1 mol·L-1 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、3.4 mol·L-1 己二醇和pH 8.5条件下出现细小成簇的针状晶体.结论:HpPrtC是一种亲水型蛋白,呈二聚体构造,在适宜条件下呈细小成簇针状晶体,其具有T淋巴细胞和B淋巴细胞优势抗原表位,可作为Hp疫苗设计的抗原,用于构建多价融合疫苗或多表位疫苗,本研究结果为Hp的防治提供了实验基础.

目的 了解GPC3蛋白结构,构建GPC3蛋白的原核表达纯化系统,高效表达和纯化出GPC3蛋白.方法 从GenBank中获取基因序列,通过Protparam、SOPMA、SWISS-MODEL等在线软件对GPC3蛋白(25-554 aa)的结构进行分析.从不同载体和菌株中筛选出相对优势的组合,优化其表达条件,并诱导表达TrxA-GPC3融合蛋白,通过包涵体的溶解和复性、亲和层析、标签切割和分子筛纯化等方法分离纯化出无TrxA标签的GPC3蛋白.结果 GPC3蛋白的相对分子质量为60.26 kDa,等电点为5.76,不稳定系数为41.27,脂肪系数为83.66,平均亲水系数为-0.312,是不稳定的亲水性蛋白,其主要为α-螺旋和无规则卷曲结构,引入标签的TrxA-GPC3融合蛋白比GPC3蛋白更稳定.通过对比筛选出表达效率较高的BL21(DE3)-pET32a-GPC3工程菌,其在0.5%的葡萄糖浓度和0.1 mmol/L的IPTG浓度条件下,结合20℃的诱导温度及16h的诱导时间,可显著提高蛋白表达量,通过亲和层析得到纯度90%以上的TrxA-GPC3融合蛋白,利用凝血酶将TrxA标签切除,最后通过分子筛纯化得到单一的GPC3蛋白.结论 利用生物信息学分析了GPC3蛋白的理化性质和结构,并在原核系统中成功表达和纯化了GPC3蛋白,为高特异性抗体的制备或筛选以及结构-功能研究奠定了基础,同时也为其它蛋白的表达纯化提供科学的指导意义.

目的 RNA降解复合体是RNA在生物体内更新的主要工具.PNPase通过3'到5'核酸外切酶降解RNA,Rnase E参与其调控.通过对绿脓杆菌RNA降解蛋白PNPase与Rnase E进行克隆表达纯化,并获取复合物蛋白,进而揭示PNPase与Rnase E对绿脓杆菌RNA的降解机制.方法对PNPase与Rnase E基因序列进行PCR扩增,构建重组质粒,分别转入E.coli BL21中表达,应用镍离子亲和层析,离子亲和层析和分子筛纯化目的蛋白PNPase与Rnase E;通过Pull-down方法验证PNPase和Rnase E的相互作用.结果成功克隆、表达、纯化绿脓杆菌PNPase与Rnase E蛋白,并通过Pull-down获得大量PNPase-Rnase E复合物.结论PNPase与Rnase E蛋白能相互作用并形成PNPase-Rnase E复合物.

目的 了解无创正压通气(NPPV)治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)伴Ⅱ型呼吸衰竭患者的供氧浓度和吸入氧浓度现状,为提高无创呼吸机治疗效果提供实证依据.方法 采用横断面研究设计对四川省30家综合性医院的呼吸内科病房终端氧浓度、呼吸机出口端氧浓度和接受NPPV治疗的AECOPD伴Ⅱ型呼吸衰竭患者鼻/面罩内实际吸入氧浓度进行测量或统计.结果 30家医院均为医院中心供氧,其供氧方式有3种:分子筛制氧机供氧5个(16.7%);液态氧供氧7个(23.3%);以制氧机和液态氧的混合供氧18个(60.0%).病房终端总体供氧浓度为(85.60±5.65),呼吸机出口端氧浓度低于治疗氧浓度预设值(P <0.05).同时给予40%给氧浓度时,鼻/面罩内实测吸入氧浓度为(33.36±1.29),且吸入氧浓度随着吸气相正压(IPAP)升高有下降趋势.结论 相关部门必须加强对病房终端、呼吸机出口端以及鼻/面罩内实际吸入氧浓度的质量监测,并根据监测结果适度提高NPPV治疗过程中治疗氧浓度预设值,从而保障患者有效的氧疗.

目的 为研究P[6]基因型轮状病毒受体结合特性,利用原核表达纯化得到P[6]基因型轮状病毒LL4260毒株的VP8*核心区蛋白.方法 将P[6]基因型毒株LL4 260株的质粒利用PCR扩增得到核心区基因片段,克隆到pET30a载体中构建重组质粒pET30a-LL4260VP8+ core,重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中进行蛋白表达,经亲和层析和分子筛层析纯化表达后得到目的蛋白.结果 P[6]基因型轮状病毒LL4260毒株核心区pET30 a-LL4260VP8* core蛋白为可溶表达,经纯化及电泳鉴定,得到相对分子质量为22×103的目的蛋白.结论 本研究构建的P[6]基因型轮状病毒LL4260毒株pET30 a-LL4260VP8* core重组质粒,表达纯化了相应核心区目的蛋白,为进一步分析蛋白的性能和结构提供基础.

目的·探讨肾功能快速进展为终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的IgA肾病患者与肾功能长期稳定的IgA肾病患者血清IgA1对体外培养的正常人肾小球系膜细胞(human mesangial cells,HMCs)增殖的刺激作用及对转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达水平的影响.方法·9例经肾活检确诊为原发性IgA肾病的患者,根据病情进展情况分为肾功能快速进展组(n=6)和肾功能长期稳定组(n=3).采用亲和层析及分子筛提取血清IgA1;用不同质量浓度(10、50、250、1 000 μg/mL)的IgA1分别干预HMC 12、24 h.CCK8法测定细胞增殖率;real-time PCR测定TGF-β1 mRNA表达;ELISA法测定TGF-β1蛋白表达.结果·肾功能快速进展组及肾功能长期稳定组患者血清IgA1对HMC有明显的促增殖作用,且表现为时间依赖性和浓度依赖性,作用高峰质量浓度分别为250 μg/mL和1 000 μg/mL.2组患者血清IgA1均能显著上调TGF-β1的mRNA和蛋白的表达.在肾功能快速进展组,IgA1质量浓度为10 μg/mL时TGF-β1的mRNA及蛋白水平达到高峰,其后随刺激浓度升高而递减;在肾功能长期稳定组, TGF-β1水平则与血清IgA1呈现平行的浓度依赖性.结论· 肾功能快速进展及长期稳定的患者血清IgA1在一定浓度和时间范围内均具有刺激HMC增殖的作用.在较低质量浓度(10～50 μg/mL)范围内,促增殖作用没有明显差异,但肾功能快速进展的患者血清IgA1上调TGF-β1表达的作用更强,提示血清IgA1具有一定的预后评估作用.

构建并表达HIV-1 CAP2NC蛋白,探索其体外自组装条件.通过PCR技术扩增HIV-1 (NL4-3 毒株)CAP2NC 基因片段,并将其连接到原核表达载体pTO-T7,获得重组质粒pTO-T7-CAP2NC,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经疏水层析纯化后获得重组蛋白CAP2NC.SDS-PAGE 结果表明,重组蛋白CAP2NC可在大肠杆菌可溶高效表达,经纯化后纯度约为95％.ELISA 检测表明重组蛋白CAP2NC 可被HIV-1 衣壳蛋白特异性单克隆抗体识别,具有较好反应活性.重组蛋白透析后在非原性SDS-PAGE中呈现为多种聚体形式.分子筛排阻层析分析CAP2NC蛋白透析后可进行组装,负染电镜进一步观察显示CAP2NC蛋白在RNA 存在条件下,可形成空心管状颗粒,其形态结构与HIV-1 病毒衣壳体外自组装形成的类似.上述结果表明HIV-1 CAP2NC 蛋白具有体外自组装的性质,为进一步在体外研究非成熟病毒样颗粒结构奠定基础.