目的:探究孕期慢性应激对子代雌性大鼠抑郁行为及海马组织印记基因胰岛素样生长因子-2 (insulin-like growth factor-2，IGF-2)/长链非编码RNA(lncRNA)H19甲基化的影响。方法:32只SPF级雌性SD大鼠按照随机数字表法分为模型组和对照组，模型组大鼠采用慢性不可预知性温和应激(chronic unpredictable mild stress model，CUMS)方法建立抑郁模型，对照组正常饲养。应激刺激第7天时，雌雄鼠合笼交配。在应激刺激前1 d和应激刺激第1、7、14、21、28天对两组母鼠行内眦静脉采血，测定血浆皮质酮浓度；在雌性仔鼠出生后第28天和出生后第42天时，每组随机抽取8只，行内眦静脉采血后测定血浆皮质酮浓度；在出生后第42天时，分别通过糖水偏爱实验、悬尾实验和强迫游泳实验测定两组雌性仔鼠的抑郁样行为。采用RT-PCR和Western blot法检测仔鼠海马组织中IGF-2/H19及相关转移酶表达情况。利用Methyl Target技术，对IGF-2差异性甲基化区域(differentially methylated region，DMR)片段2的19个CpG位点，H19印记控制区(imprinting control region，ICR)片段1中8个CpG位点和H19-ICR片段2的15个CpG位点，同时捕获测序，计算每个CpG位点甲基化水平。采用SPSS 26.0，采用重复测量方差分析、 t检验和非参数检验对相关数据进行统计分析。 结果:(1)重复测量方差分析结果显示，母鼠血浆皮质酮的时间与组别的交互效应不显著( F＝2.997， P＝0.066)，时间主效应显著( F＝4.44， P＝0.010)，组别主效应显著( F＝41.40， P＝0.001)。组间因素的单独效应分析，在应激第14、21、28天，模型组母鼠血浆皮质酮浓度均高于对照组母鼠(均 P<0.001)。(2)在糖水偏爱实验中，模型组雌性仔鼠的液体总消耗[11.10(10.38，11.58)mL，13.55(12.00，15.77)mL， Z＝－3.055， P＝0.002]、1%蔗糖水消耗[(5.50±1.30)mL，(8.56±2.04)mL， t＝－3.582， P＝0.003]及1%蔗糖偏爱百分比[(51.35±8.69)%，(62.11±8.05)%， t＝－2.576， P＝0.022]均低于对照组。(3)模型组雌性仔鼠悬尾实验中静止持续时间[(126.95±39.89)s，(54.30±25.00)s， t＝4.375， P＝0.001]和强迫游泳实验中持续不动时间[(7.97±6.66)s，(1.85±2.12)s， t＝2.478， P＝0.037]均长于对照组。(4)模型组雌性仔鼠海马组织IGF-2 mRNA[(0.46±0.24)，(1.00±0.00)， t＝3.821， P＝ 0.019]、H19 mRNA[(0.60±0.25)，(1.00±0.00)， t＝3.574， P＝0.007]表达均低于对照组；模型组雌性仔鼠IGF-2蛋白相对表达低于对照组[(0.77±0.04)，(1.00±0.00)； t＝9.876， P＝0.01)；CCTC结合因子(CCTC-binding factor，CTCF)的mRNA[(1.29±0.12)，(1.00±0.00)， t＝－4.850， P＝0.003]和蛋白相对表达水平[(1.90±0.28)，(1.00±0.00)， t＝－5.513， P＝0.005]均高于对照组。(5)模型组雌性仔鼠海马组织IGF-2 DMR区域3个CpG位点甲基化水平均低于对照组( t＝－3.21，－3.00，－3.34，均 P<0.05)，分别位于chr1215831028、chr1215831055和chr1215831205；IGF-2 DMR片段甲基化水平低于对照组( t＝－3.453， P＝0.048)；模型组雌性仔鼠甲基转移酶DNMT3A mRNA( t＝5.102， P＝0.002)、DNMT3A( t＝10.213， P<0.001)和DNMT3B( t＝4.169， P＝0.014)蛋白相对表达水平均低于对照组。 结论:孕期慢性应激致雌性仔鼠出现抑郁、绝望状态，其机制可能与甲基化转移酶表达降低引起印记基因IGF-2 DMR甲基化水平降低有关。

周期蛋白在细胞增殖过程中呈现周期性表达变化,不同的周期蛋白通过结合周期蛋白激酶(cyclin-dependent kinase,CDKs)及靶向特定蛋白质参与细胞有丝分裂和减数分裂过程的精确调控.嗜热四膜虫有性生殖期特异表达的B3型周期蛋白Cyc2(cyclin 2,Cyc2)对减数分裂的启始是必需的,但Cyc2蛋白的分子调控机制并不清楚.本研究通过0.1μg/mL和0.3μg/mL镉离子诱导突变细胞株OE-CYC2-B2086和OE-CYC2-CU428中CYC2基因在金属硫蛋白1基因(metallothionein gene 1,MTT1)启动子调控下上调表达.实时荧光定量PCR检测突变株OE-CYC2-B2086和OE-CYC2-CU428中CYC2的转录水平分别上调7.8倍和9.8倍.细胞有性生殖发育进程的荧光显微观察发现CYC2的表达上调并不影响有性生殖前期减数分裂的启始,但是干扰四膜虫有性生殖后期中新大核和新小核的正确形成.同时突变株OE-CYC2-B2086和OE-CYC2-CU428交配后,在镉离子诱导下不能产生有性生殖后代,但是该突变株分别和两种不同野生型细胞或CYC2敲除的突变细胞株交配能够恢复产生3％,15％或32％的有性生殖后代,有性生殖发育异常程度与CYC2的表达水平成正相关.进一步突变Cyc2第312位磷酸化位点丝氨酸为丙氨酸,获得CYC2单位点突变细胞株CYC2-S312A-B和CYC2-S312A-C.丝氨酸单位点突变阻止了四膜虫有性生殖期小核减数第1次分裂起始.结果 表明周期蛋白2的表达水平和磷酸化修饰影响了不同阶段细胞核的功能,周期蛋白2对四膜虫有性生殖发育的正常进行是必需的.

大多数可栽培的食用菌是属于担子菌的大型真菌,具有复杂的交配型系统,通常涉及到两类交配型基因,即编码同源域转录因子的A交配型基因以及编码脂肽信息素和信息素受体的B交配型基因.对担子菌交配型系统的研究已经有上百年的历史,近年来随着高通量测序技术的发展,很多常见食用菌的基因组获得测序,使得我们对不同类型交配型位点的分子遗传学结构能够进行更加细致的解析.本文在概述了担子菌有性生殖系统和交配型基因分子特点的基础上,对常见食用菌中的香菇、金针菇、灵芝、糙皮侧耳、刺芹侧耳、白灵侧耳、裂褶菌、双孢蘑菇、草菇和虎皮香菇以及模式生物灰盖鬼伞等物种的交配型位点的结构进行了总结和分析.从已有的研究结果来看,常见食用菌的交配型位点的分子遗传学结构存在多样性,不同物种的交配型位点具有不同的结构特点.从物种内不同菌株之间的交配型结构比较来看,交配型基因的位置和数量也具有丰富的多样性.在分子遗传学层面对常见食用菌交配型位点结构的认识将有助于深入阐明交配型基因对子实体发育的调控以及解决食用菌生产实际中的科学问题,但是目前对食用菌交配型位点和基因的研究仍旧存在很多空白,有待于进一步深入和拓展.

肺形侧耳味道鲜美,营养丰富,深受广大消费者喜爱.它属于四极性异宗结合担子菌,但其交配型位点结构仍未被解析.本研究利用二代测序技术对肺形侧耳的基因组进行测序,通过生物信息学方法找到了肺形侧耳野生菌株X1菌株后代单核菌株的交配型位点.结果 显示肺形侧耳的A交配型位点较为特异,2株原生质体单核化菌株(X1-1和X1-15)的A交配型位点结构差异较大,X1-1含一对保守的HD1和HD2基因,而X1-15除了一对HD1和HD2基因外,还含有额外的2个HD2基因和1个HD1基因.肺形侧耳的B交配型位点与其他担子菌的交配型位点相似,含有8个信息素受体基因和1个信息素前体基因.本研究揭示的肺形侧耳特异的交配型位点结构为后期的遗传育种提供了理论依据.

本研究在分析金针菇减数分裂重组热点时发现B交配型位点可能存在第三个亚位点,为此对同核菌株‘6-3’和‘6-21’的B交配型位点进行全基因组注释,获得8对同源信息素受体基因(pheromone receptor gene,pr)和3对同源信息素前体基因(pheromone precursor gene,PP),组成了2个结构完整、相距326kb的亚位点α和β;‘6-21’菌株还发现1个‘6-3’菌株不具有的pr,组成第3个亚位点γ,它与亚位点α和β没有连锁.‘6-3’和‘6-21’配对形成异核体后出菇,分离获得142个单孢菌株,其B交配型有8种基因型,通过亲和性试验得到证实,同时还验证了第3个亚位点γ具有与α、β相同的功能.

大球盖菇Stropharia rugosoannulata是一种具有较强木质纤维素降解能力以及高营养的重要食用菌.此菌属于四极性异宗结合担子菌,但是交配型位点结构仍未被解析.本研究利用基因组数据通过生物信息学方法进行大球盖菇的A和B交配型位点解析,并与其他大型真菌进行比较.结果 显示大球盖菇的A交配型位点包含了一对保守的HD1和HD2基因,位点上下游基因的共线性较高,与Galerina patagonica和砖红韧黑伞Hypholoma sublateritium相似度最高,A位点结构上也较为保守,在上下游具有保守的MIP、Sec61蛋白、甘氨酸脱氢酶和β侧翼蛋白.B位点包含5个信息素受体和3个信息素前体基因,与其他真菌相比较发现,B位点及上下游基因的共线性较差,表明在不同的真菌中B位点变异性较大.本研究所获得的结果将有助于诠释大球盖菇交配型位点结构,为今后的遗传育种提供了理论依据.

刺芹侧耳是一种典型的具四极性交配型系统的担子菌,通常需要一对可亲和的单核菌丝体才能够形成稳定的双核菌丝体.本研究将刺芹侧耳单核菌株181 (A1B1)中A和B交配型基因HD1和HD2以及信息素前体基因PEphb3.1和PEphb3.3克隆后,通过PEG介导的方式敲入到可亲和的单核菌株183(A2B2)中,获得了22个阳性转化子.运用荧光显微镜对其中11个具有锁状联合的转化子进行了详细观察,描述了锁状联合和细胞核相.研究结果为进一步开展交配型基因的遗传操作研究提供了方法学上的借鉴和参考.本文还探讨了同核双核体的概念和应用价值.

棉铃虫Helicoverpa armigera主要借助于性信息素通讯完成雌雄识别,实现交配和种群繁衍.关于棉铃虫感受性信息素机制的研究一直是我国化学生态学领域的热点和重心,研究结果有助于开发和改进棉铃虫防治的性引诱剂.本文将对棉铃虫雄虫感受雌虫释放的性信息素的机制进行综述,以期为深入研究棉铃虫及其他相关昆虫的性信息素感受的分子和神经机理提供参考.棉铃虫雌虫性信息素腺体合成和释放多种长链、饱和或非饱和的脂肪醛和醇等化合物,其中Z11-16:Ald为主要性信息素成分,Z9-16: Ald和Z9-14: Ald为次要性信息素成分,不同组分按一定比例混合可明显增强对雄性棉铃虫的引诱效果,而化合物Z11-16: OH和高剂量的Z9-14: Ald对性信息素引诱活性具有明显的抑制效果.相应地,雄性棉铃虫触角上A,B和C3种类型的毛形感器能够感受这些信息化合物.A类型毛形感器内表达受体OR13感受Z11-16∶Ald,B类型毛形感器内表达OR14b感受Z9-14: Ald,C类型毛形感器内表达OR6和OR16感受Z9-16: Ald,Z9-14: Ald,Z11-16:Ac和Z11-16: OH.受体的表达位置和功能与不同类型毛形感器的电生理反应特性相一致.钙离子成像证明在棉铃虫触角叶内的3个扩大型神经纤维球接受这些气味信息,其中神经纤维球云状体接受Z11-16: Ald,背中间后侧纤维球接受Z9-16: Ald,背中间前侧纤维球接受Z9-14: Ald,Z11-16:Ac和Z11-16: OH.这些研究成果在感器、受体和脑中枢水平上揭示了棉铃虫感受性信息素的机制,在这些研究基础上,我们认为需要深入开展以下方面的研究:(1)进一步鉴定相关性信息素受体的功能和定位;(2)深入研究脑内嗅觉高级中枢对性信息素信息的处理和整合神经机制;(3)明确棉铃虫性信息素感受受到寄主植物、光周期、温度、湿度等环境因素的影响及机制.

芳香化酶是调节雄激素向雌激素合成转换的关键酶.脑型芳香化酶(cyp19b)的表达在成鱼青鳉的脑中呈现显著雌雄性差异,在性腺中微弱表达且无明显性别差异.为探讨cyp19b基因的生理功能,采用CRISPR/Cas9系统靶向敲除cyp19b基因.在青鳉cyp19b基因的第2和第4外显子上分别设计一个靶位点,通过显微注射gRNA和Cas9蛋白到一细胞期的受精卵进行cyp19b双靶点基因敲除.研究结果表明:成功获得两种可遗传的cyp19b突变等位基因型种鱼,并通过杂合子交配、基因组PCR及DNA测序分析,选育得到两种cyp19b敲除突变型纯合子品系.表型观察分析显示,两种突变型纯合子品系均无明显雌雄性偏差,胚胎均可以正常发育,成鱼均可以正常生殖,提示cyp19b基因的缺失可能不直接影响性腺的雌雄性分化.cyp19b基因如何影响性腺分化和发育,有待进一步深入探讨.

柱状田头菇(茶树菇)Cyclocybe aegerita在我国广泛种植,其菌株资源分为多个类群且遗传背景多样.多种命名和复杂的交配特征给柱状田头菇及近缘种的育种研究带来障碍.以两个物种柱状田头菇和杨柳田头菇C.salicacola菌株群体为研究材料,通过基因组测序及序列分析,设计特异引物扩增获取菌株群体的交配区域片段,用于菌株鉴定及系统构建.克隆获得了两个柱状田头菇菌株的B交配位点,其中约8 kb的片段序列非常保守,包括信息素受体rcb1、rcb2和部分非编码区.基于该区域含有变异区的片段设计特异引物,经对35个菌株扩增及克隆测序后,每个实验菌株中均获得1-2类型约3.2 kb片段(cbmr).使用该片段与线粒体小亚基构建的聚类树契合度较高,但前者在类群的划分上更为精细.此外,该片段的变异区也为类群和交配型鉴定提供了靶位点.依据B交配型部分位点设计的引物在所有的实验菌株中均获得相应的片段,可以作为分子标记用于柱状田头菇和杨柳田头菇菌株及B交配型分子鉴定.