目的:建立用于人呼吸道合胞病毒（HRSV）中和抗体滴度检测的噬斑减少中和实验（PRNT），并进行条件优化与初步应用。方法:应用CHO表达系统制备帕利珠单克隆抗体（Palivizumab），同时对细胞种类、细胞培养时间、固定通透方法、封闭方法等影响因素进行优化。验证该方法的重复性，并与传统PRNT验证其相关性。利用优化的PRNT方法检测BALB/c小鼠血清（融合蛋白肌肉注射免疫）对HRSV A和B亚型的中和抗体滴度。结果:Palivizumab的表达量约为50 mg/L。PRNT的最佳工作条件为：培养细胞为HEp-2细胞，细胞培养时间为2 d，最佳固定通透方式为4%（V/V）多聚甲醛室温固定15 min后0.2%（V/V）Triton X-100通透15 min，去掉封闭步骤。优化后该方法的重复性验证总体变异系数均<15%，与传统PRNT呈现良好的线性关系，Spearman相关系数 r s高达0.983。在检测小鼠血清对HRSV A亚型long株和B亚型9320株的中和抗体滴度时，融合蛋白联合AlOH和CpG佐剂诱导小鼠产生的中和抗体滴度最高。 结论:本研究建立的HRSV中和抗体检测方法快速、可重复、高通量，能够适用于A、B亚型HRSV的中和抗体检测。

目的:构建一种新的靶向CD123抗原的双特异性抗体（CD123 DuAb），研究CD123DuAb在急性髓系白血病（AML）治疗中的作用。方法:以自主研发的CD123单克隆抗体可变区为基础，利用分子克隆技术，构建CD123 DuAb表达质粒，转染ExpiCHO-S细胞，表达该双功能抗体。通过功能实验，验证CD123 DuAb在T细胞活化及增殖中的作用，及其促进T细胞对AML细胞的杀伤作用。结果:①构建了CD123 DuAb表达质粒，并通过Expi-CHO真核系统表达。②CD123 DuAb可以分别与T细胞上的CD3位点及CD123阳性肿瘤细胞上的CD123位点结合。③将1 nmol/L CD123 DuAb加入T细胞与MV4-11细胞共培养体系中，T细胞中CD69阳性表达率为68.0%，CD25阳性表达率为44.3%，均显著高于对照组（ P值均<0.05）。④在CD123 DuAb浓度为1 nmol/L的条件下培养T细胞，可促进T细胞增殖，其绝对计数第1天为5×10 5/ml，第9天扩增至3.2×10 6/ml，且CFSE荧光强度显著降低。⑤CD123 DuAb能够显著激活T细胞，且激活强度与其浓度呈正相关，浓度为1 nmol/L时，T细胞CD107a表达率可达16.05%，较对照组显著升高（ P<0.05）。⑥随培养体系中CD123 DuAb浓度的升高，T细胞耗竭和凋亡也随之增加，浓度为1 nmol/L时，T细胞CD8 +PD-1 +LAG-3 +比例为10.90%，PI -Annexin Ⅴ +比例为18.27%，PI +Annexin Ⅴ +比例为11.43%，均较对照组显著升高（ P<0.05）。⑦CD123 DuAb能够促进T细胞分泌细胞因子，浓度为1 nmol/L时，共培养体系上清中的IFN-γ和TNF-α的浓度可分别达到193.8 pg/ml和169.8 pg/ml，较对照组显著升高（ P<0.05）。⑧将CD123 DuAb以1 nmol/L的浓度加入T细胞与CD123阳性肿瘤细胞共培养体系中，能显著增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，共培养3 d，CD123 +MV4-11细胞、CD123 +Molm13细胞和CD123 +THP-1细胞的残留率分别为7.4%、6.7%和14.6%，较对照组显著降低（ P<0.05）。 结论:本研究构建及表达了一种靶向CD123的双特异性抗体，并通过体外实验验证其可以同时结合CD123阳性肿瘤细胞和T细胞，促进T细胞的活化和增殖，增强其抗白血病作用，为进一步临床研究提供了基础。

目的 通过无血清悬浮驯化CHO-K1细胞,筛选出单克隆源性可追溯、生长状态良好的宿主细胞株,并进行表达验证.方法 采用逐步降低血清含量的方法,将贴壁状态的CHO-K1细胞驯化成适应无血清培养基培养的悬浮细胞;通过单细胞接种/成像系统Verified In-Situ Plate Seeding(简称VIPS系统)筛选单克隆,经连续培养综合评估单克隆细胞的倍增时间、结团率、细胞直径等参数,确定候选克隆;将候选克隆分别转染携带绿色及红色荧光蛋白的质粒,根据荧光蛋白表达情况确定1株克隆作为工程细胞株的宿主细胞.结果 驯化获得的CHO-K1细胞适应无血清悬浮培养,倍增时间为20～24 h;通过单克隆筛选和产量评估确定的单克隆细胞株单克隆源性良好且可追溯,以0.5 × 106个/mL的细胞密度接种,培养7 d最高细胞密度可达8.27 × 106个/mL,活率不低于80％,平均倍增时间20.31h,能较好地表达外源基因.结论 通过无血清驯化培养,成功获得单克隆源性可追溯、生长状态良好且能够用于蛋白高表达的CHO-K1细胞株.

目的 采用Plackett-Burman实验和响应面法(response surface methodology,RSM)优化酵母源无血清培养基(serum-free medium,SFM)的营养组分,明确培养基成分及浓度.方法 以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为研究对象,在实验室前期筛选出的SFM的基础上,采用Plackett-Burman实验对10种营养组分进行筛选.筛选出对细胞具有促生长作用的因素后,利用RSM进行二次优化,以阐明各变量间的相互作用,确定促CHO细胞生长的最佳培养基组成.取对数生长期CHO细胞,用优化后的培养基重悬后,进行传代扩增.结果 经Plackett-Burman实验筛选的10个变量中,酵母抽提物(yeast extract,YE)FM888和微量元素能有效提高细胞比生长速率;非必需氨基酸和FM888对提高细胞存活天数作用显著;FM888、必需氨基酸、非必需氨基酸及微量元素能显著提高活细胞密度.综合选择FM888、微量元素和非必需氨基酸3个因素进行RSM优化试验.优化后的培养基悬浮培养CHO细胞时,其最大比生长速率可达0.025/h,存活天数可达6 d,最大活细胞密度可达7.187 × 106个/mL.将优化后的培养基进行细胞稳定传代试验,可稳定传代12代,其活细胞密度及细胞活率与对照组(商业化SFM)接近.结论 成功获得成分明确且能支持CHO细胞高密度生长的酵母源SFM,为YE在动物细胞培养中的应用以及高效SFM的开发提供了参考和依据.

目的:为解决野生型B细胞成熟抗原(BCMA)被γ分泌酶切割导致表达不稳定的问题,构建抵抗γ分泌酶切割的BCMA突变体并构建靶细胞,用于评价BCMA CAR-T细胞的杀伤功能.方法:将野生型BCMA的穿膜域替换为人CD8α穿膜域,构建抵抗γ分泌酶切割的BCMA突变体(BCMA-CD8α TM),构建过表达该突变体的U266(U266BCMA Mut)、K562(K562BCMA Mut)、SKOV3(SKOV3BCMA Mut)和CHO(CHOBCMA Mut)细胞;构建装载NFAT-EGFP报告基因的BCMA CAR Jurkat细胞(BCMA-CAR-Jurkat-Reporter)与U266BCMA Mut细胞共培养,采用FCM检测该细胞中EGFP表达水平以指示NFAT激活水平,荧光素酶法检测BCMA CAR-T细胞对Luciferase标记的K562BCMA Mut细胞的杀伤作用,实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)检测BCMA CAR-T细胞对SKOV3BCMA Mut和CHOBCMA Mut细胞的杀伤作用.结果:应用γ分泌酶抑制剂LY411575抑制γ分泌酶活性,显著增强野生型U266细胞表面BCMA表达水平,平均荧光强度上调10倍以上;但撤除抑制剂后BCMA表达水平逐渐降低(P<0.01);BCMA-CD8α TM突变体可抵抗γ分泌酶的切割作用,在U266细胞表面稳定表达(P>0.05);U266细胞及过表达BCMA-CD8α TM的U266细胞与BCMA-CAR-Jurkat-Reporter细胞共培养后都可激活Reporter系统、增强EGFP表达,但该效应在BCMA-CD8α TM过表达的U266细胞中更显著(P<0.01);BCMA-CD8α TM在BCMA表达阴性的K562、SKOV3和CHO 3种靶细胞中成功过表达,且在LY411575处理下该突变体的表达水平仅有小幅度升高;荧光素酶法检测结果显示,不同效靶比下,BCMA CAR-T细胞均可特异、高效杀伤过表达BCMA-CD8α TM的K562细胞;RTCA结果显示,不同效靶比下,BCMA CAR-T细胞均可有效识别、杀伤过表达BCMA-CD8α TM的SKOV3和CHO细胞,但同等效靶比下的Mock-T细胞无此效应.结论:本实验构建的BCMA-CD8α TM突变体能够抵抗γ分泌酶的切割,在多种靶细胞表面稳定表达,为评价BCMA CAR-T细胞体外杀伤的有效性和特异性提供多种检测手段.

为利用中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovarian,CHO)细胞表达系统制备重组猪干扰素-γ(recombinant porcine interferon gamma,rPoIFN-γ),并分析其体外抗病毒活性,本研究首先构建rPoIFN-γ真核表达质粒 pcDNA3.1-PoIFN-γ,转染悬浮培养的 CHO细胞,进行上清分泌表达,利用亲和层析纯化目的蛋白,并进行 SDS-PAGE 和 Western blotting 鉴定;通过 CCK-8 实验分析rPoIFN-γ对细胞的毒性,用VSV/PK-15 系统检测其抗病毒活性效价;最后分析rPoIFN-γ对塞内卡病毒A(Seneca virus A,SVA)的抗病毒活性及其对细胞内干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)和细胞因子的诱导作用.结果显示,本研究利用 CHO 悬浮细胞表达系统成功制备了纯化的rPoIFN-γ,该rPoIFN-γ对细胞无毒性,VSV/PK-15 系统检测其活性效价为 5.59×107 U/mg;此外,rPoIFN-γ 可诱导细胞内多种 ISGs 和细胞因子的表达,并显著抑制 SVA 的复制.总之,本研究成功利用 CHO表达系统制备了高活性的 rPoIFN-γ,并在体外完成其对 SVA的抗病毒作用分析,为rPoIFN-γ的功能及抗病毒制剂的研究提供了实验材料和基础.

为实现体外大规模制备单纯疱疹病毒HSV-IgM(HSV1,HSV2)人鼠嵌合抗体,本研究通过RNA 连接酶介导的 cDNA 末端快速扩增(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM-RACE)技术获取其对应杂交瘤细胞基因序列,构建嵌合抗体至真核表达载体,在CHO-S细胞中稳定表达所需目的蛋白.同时优化稳定细胞株筛选工艺,对细胞池构建阶段和单克隆筛选阶段的加压条件进行摸索与探究,最后目的抗体采用蛋白L亲和纯化法进行纯化并进行生物活性检测;最终成功制备899 kDa和 909 kDa的稳定高表达重组IgM抗体(HSV1,HSV2)细胞株.结果表明,最适筛选压力为 20P200M(一轮加压)和 50P1000M(二轮加压);使用加压培养基进行单克隆筛选抗体表达量较高,HSV1-IgM和HSV2-IgM单克隆最终表达量分别为 1 620 mg/L和 623 mg/L.本研究为HSV1和HSV2的IgM系列重组抗体质控品开发以及体外高表达分泌IgM亚型抗体提供理论与实践基础.

本研究利用中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)Erns蛋白,并分析其免疫原性.以BVDV-1 NADL标准毒株基因序列为基础,构建 BVDV Erns蛋白重组真核表达质粒 pcDNA3.1-BVDV-Erns,转染悬浮培养的CHO 细胞,进行上清分泌表达.SDS-PAGE 分析 Erns蛋白的表达和纯化,并用抗 His单克隆抗体和BVDV阳性血清进行Western blotting鉴定纯化蛋白;进一步使用纯化的Erns蛋白免疫新西兰大白兔,通过间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和细胞间接免疫荧光(indirect immunofluorescence,IFA)实验检测血清抗体水平及其免疫反应活性,用病毒中和实验测定免疫兔血清的中和抗体滴度.BCA蛋白定量试剂盒检测纯化的Erns蛋白浓度为 0.886 mg/mL,Western blotting结果显示,抗His单克隆抗体和BVDV阳性血清均能够与纯化的Erns蛋白发生特异性免疫反应.间接ELISA和IFA实验结果显示,一免后第 7 天血清抗体呈阳性,并持续至免疫后第 28 天,血清抗体效价水平可达 1:128 000,且该血清抗体可以与MDBK细胞中感染的BVDV病毒发生特异性免疫反应.重组Erns蛋白免疫兔可诱导动物机体产生病毒中和抗体,中和效价为log10=2.71.本研究利用CHO细胞表达系统成功制备了纯化的BVDV Erns蛋白,并通过体内和体外实验证明,该重组蛋白具有良好的免疫原性,为牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea,BVD)诊断方法及新型亚单位疫苗的研制奠定了基础.

帕利珠单抗(Synagis)是用于预防呼吸道合胞病毒的经典药物,但由于价格昂贵,限制了其应用范围.该研究采用中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达帕利珠单抗类似药,并以响应面设计法对培养关键参数进行优化,筛选培养基组合以提高产量.研究结果显示,优化工艺参数为以AM01-AF02为基础-补料培养基,每1 mL含5.0×106个细胞的密度接种,37℃培养7d后,降温至33.0 ℃,培养至d16.该工艺条件下,可将帕利珠单抗类似药的产量在摇瓶和3 L生物反应器中分别提升69.3％和30.0％.随后,对生物反应器上发酵生产的抗体进行了纯化工艺研究,为帕利珠单抗类似药的后续工艺开发提供了参考.

目的 研究培养基添加剂(锰离子、锌离子和丁酸钠)对表达双特异性抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生长、抗体产量及关键质量属性的影响.方法 利用JMP 13.0软件响应曲面设计-中心复合设计,研究培养基添加剂对细胞生长、抗体产量及Man5糖型含量的影响.结果 在细胞培养过程中添加1000 nmol·L-1氯化锰、30 μmol·L-1硫酸锌和250μmol·L-1 丁酸钠,可使峰值活细胞密度提高11.8％,抗体产量提高14.5％,Man5糖型含量降低28.9％.结论 锰离子、锌离子和丁酸钠在提高双特异性抗体产量和降低Man5糖型含量方面发挥了关键作用.