目的 采用Plackett-Burman实验和响应面法(response surface methodology,RSM)优化酵母源无血清培养基(serum-free medium,SFM)的营养组分,明确培养基成分及浓度.方法 以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为研究对象,在实验室前期筛选出的SFM的基础上,采用Plackett-Burman实验对10种营养组分进行筛选.筛选出对细胞具有促生长作用的因素后,利用RSM进行二次优化,以阐明各变量间的相互作用,确定促CHO细胞生长的最佳培养基组成.取对数生长期CHO细胞,用优化后的培养基重悬后,进行传代扩增.结果 经Plackett-Burman实验筛选的10个变量中,酵母抽提物(yeast extract,YE)FM888和微量元素能有效提高细胞比生长速率;非必需氨基酸和FM888对提高细胞存活天数作用显著;FM888、必需氨基酸、非必需氨基酸及微量元素能显著提高活细胞密度.综合选择FM888、微量元素和非必需氨基酸3个因素进行RSM优化试验.优化后的培养基悬浮培养CHO细胞时,其最大比生长速率可达0.025/h,存活天数可达6 d,最大活细胞密度可达7.187 × 106个/mL.将优化后的培养基进行细胞稳定传代试验,可稳定传代12代,其活细胞密度及细胞活率与对照组(商业化SFM)接近.结论 成功获得成分明确且能支持CHO细胞高密度生长的酵母源SFM,为YE在动物细胞培养中的应用以及高效SFM的开发提供了参考和依据.

为研究雷公藤甲素(triptolide,TP)对Ⅱ型胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)雌性大鼠生殖系统的毒性作用及机制,将 50 只SD大鼠随机分为正常组(Con),模型组(CIA),雷公藤片临床等效剂量 0.5、1、2 倍组(含雷公藤甲素3.75、7.5、15 μg·kg-1·d-1),每组 10 只,首次免疫后当日开始灌胃给药,每天 1 次,给药 42 d.分别于第 21、42 天取材,计算子宫和卵巢脏器指数;显微镜下观察子宫和卵巢组织病理形态学变化;ELISA法检测卵巢组织匀浆中雌二醇(estradiol,E2)及细胞色素P450A1(aromatase,CYP19A1)水平;免疫组织化学法检测卵巢组织中通路相关蛋白转化生长因子 β3(transforming growth factor β3,TGFβ3)、细胞信号传导分子 3(mothers against decapentaplegic homolog 3,Smad3)及肾上腺核受体 1(steroido-genic factor-1,SF-1)表达水平.并在体外建立中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞系,经TP给药(30、60、120 nmol·L-1)24 h后MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测细胞中TGFβ3、Smad3 及SF-1蛋白表达,并通过免疫荧光检测SF-1因子入核情况.结果表明,与模型组比较,TP各给药组在给药21、42 d子宫腺体数、总卵泡数、成熟卵泡数、黄体数均有降低趋势,但差异并无统计学意义,仅 2 倍TP在给药 42 d时可显著增加闭锁卵泡数;TP 3.75 μg·kg-1·d-1在给药 21 d 即可显著降低 E2 水平,但对雌激素合成限速酶 CYP19A1 无显著影响,但可显著降低卵巢组织TGFβ3、Smad3 因子表达,且无论给药 21 d还是 42 d,TP 7.5、15 μg·kg-1·d-1均显著降低SF-1 因子表达.TP可显著促进体外卵巢细胞凋亡,给药 24 h后,凋亡主要集中在凋亡晚期;且 60 nmol·L-1 TP即可显著降低TGFβ3、Smad3 及SF-1 蛋白表达,并呈剂量依赖性.综上所述,2 倍以下临床等效剂量的TP灌胃 21、42 d并未引起CIA大鼠子宫、卵巢组织明显的生殖损伤,仅在 2 倍临床等效剂量给药 42 d时,闭锁卵泡数发生显著变化.TP通过抑制TGFβ3/Smad3/SF-1 通路表达发挥体内生殖靶器官及体外卵巢细胞生殖毒性作用.

仿果蝇眼睛的抗反射纳米涂层是一种具有巨大市场潜力的生物可降解材料,可用于制造各种需要抗反射性能的光学设备.相较于物理化学法,采用微生物表达视黄素蛋白为在温和条件下制备纳米涂层提供了新思路.然而,目前抗反射涂层的关键——视黄素蛋白的表达水平较低,难以满足大规模生产.本研究通过分析筛选果蝇来源视黄素蛋白的最佳表达宿主,优化视黄素蛋白的表达水平,确定了中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)是视黄素蛋白的高效表达宿主,获得纯化的视黄素蛋白.同时,探索羊毛脂纳米乳液的制备方法,确定了特定浓度视黄素蛋白及与蜡乳液的比例为16:4,纳米涂层形成体系pH为7.0,温度为30℃时,纳米涂层的抗反射能力最佳.本研究为人工绿色可降解抗反射涂层的未来应用奠定基础,提供了蛋白表达优化思路,并通过纳米涂层的成分确定及体系成分浓度、pH及温度的优化,增强了人工抗反射纳米涂层的抗反射能力并降低了生产成本.

为利用中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovarian,CHO)细胞表达系统制备重组猪干扰素-γ(recombinant porcine interferon gamma,rPoIFN-γ),并分析其体外抗病毒活性,本研究首先构建rPoIFN-γ真核表达质粒 pcDNA3.1-PoIFN-γ,转染悬浮培养的 CHO细胞,进行上清分泌表达,利用亲和层析纯化目的蛋白,并进行 SDS-PAGE 和 Western blotting 鉴定;通过 CCK-8 实验分析rPoIFN-γ对细胞的毒性,用VSV/PK-15 系统检测其抗病毒活性效价;最后分析rPoIFN-γ对塞内卡病毒A(Seneca virus A,SVA)的抗病毒活性及其对细胞内干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)和细胞因子的诱导作用.结果显示,本研究利用 CHO 悬浮细胞表达系统成功制备了纯化的rPoIFN-γ,该rPoIFN-γ对细胞无毒性,VSV/PK-15 系统检测其活性效价为 5.59×107 U/mg;此外,rPoIFN-γ 可诱导细胞内多种 ISGs 和细胞因子的表达,并显著抑制 SVA 的复制.总之,本研究成功利用 CHO表达系统制备了高活性的 rPoIFN-γ,并在体外完成其对 SVA的抗病毒作用分析,为rPoIFN-γ的功能及抗病毒制剂的研究提供了实验材料和基础.

帕利珠单抗(Synagis)是用于预防呼吸道合胞病毒的经典药物,但由于价格昂贵,限制了其应用范围.该研究采用中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达帕利珠单抗类似药,并以响应面设计法对培养关键参数进行优化,筛选培养基组合以提高产量.研究结果显示,优化工艺参数为以AM01-AF02为基础-补料培养基,每1 mL含5.0×106个细胞的密度接种,37℃培养7d后,降温至33.0 ℃,培养至d16.该工艺条件下,可将帕利珠单抗类似药的产量在摇瓶和3 L生物反应器中分别提升69.3％和30.0％.随后,对生物反应器上发酵生产的抗体进行了纯化工艺研究,为帕利珠单抗类似药的后续工艺开发提供了参考.

目的 研究培养基添加剂(锰离子、锌离子和丁酸钠)对表达双特异性抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生长、抗体产量及关键质量属性的影响.方法 利用JMP 13.0软件响应曲面设计-中心复合设计,研究培养基添加剂对细胞生长、抗体产量及Man5糖型含量的影响.结果 在细胞培养过程中添加1000 nmol·L-1氯化锰、30 μmol·L-1硫酸锌和250μmol·L-1 丁酸钠,可使峰值活细胞密度提高11.8％,抗体产量提高14.5％,Man5糖型含量降低28.9％.结论 锰离子、锌离子和丁酸钠在提高双特异性抗体产量和降低Man5糖型含量方面发挥了关键作用.

目的 基于高泌乳素血症探讨麦芽总生物碱中几个已知的浓度较高的组分即大麦芽碱、辛弗林、芦竹碱和多巴胺D1、D2受体感受器之间的相互作用机理,为进一步探索麦芽的药理作用提供理论基础.方法 选用能稳定表达多巴胺D1受体(DRD1)的中国仓鼠卵巢细胞的K1细胞株(CHO-K1),和能稳定性表达多巴胺D2受体(DRD2)的人胚肾细胞(HEK-293)为试验对象,用CCK-8试剂盒确定3种单体对2种细胞生存状态无不良影响后,采用分子对接法、竞争性受体配体结合实验对3个单体化合物与多巴胺受体的亲和力和调控作用进行研究.结果 大麦芽碱、辛弗林与DRD2间有较强亲和力,但均对DRD1无作用;大麦芽碱、辛弗林、芦竹碱与DRD2间有较强亲和力,且大麦芽碱、辛弗林对DRD2有显著激动作用.结论 麦芽总生物碱的3个已知单体化合物中,大麦芽碱、辛弗林对DRD2有显著激动作用,3个单体均对DRD1无显著药理作用.

已有研究表明卵壳蛋白ZPC5(Dissostichus mawsoni zona pellucida c5,DmZPC5)在南极鱼卵巢中大量表达,但是其具体功能尚不清楚.为了明确ZPC5是否参与鱼类抗寒过程,研究在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster o-vary,CHO)中过表达南极鱼ZPC5,随之给予CHO细胞一定程度的低温处理,通过统计CHO细胞的存活率,来探讨zpc5在鱼类抗寒过程中的作用.存活率检测结果发现,过表达ZPC5的CHO细胞在0℃处理16 h后,其存活率较对照组显著上升(P<0.001),证明zpc5在低温下可以促进细胞的存活.Western Blot检测结果显示,zpc5能在CHO细胞中高效表达,0℃处理后,CHO细胞内的ZPC5表达量显著上调,证明了低温可以诱导ZPC5的表达.研究结果表明,ZPC5有可能参与南极鱼鱼卵抗寒过程.

目的 研究葛根素通过抑制钠-葡萄糖协同转运蛋白2 (SGLT2)发挥促尿糖、降血糖作用.方法 同源模建获得SGLT2蛋白虚拟结构,以达格列净为阳性药,与葛根素进行分子对接,考察其分子结合强弱;采用能稳定表达人SGLT2(hSGLT2)蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、以14C_甲基葡萄糖苷([14C]-AMG)为底物,评价葛根素体外抑制SGLT2的活性;以达格列净为阳性药,采用大鼠体内口服糖耐量试验(OGTT)和尿排泄糖试验(UGE)观察葛根素直接降血糖和促尿糖活性.结果 分子对接得分显示,葛根素是SGLT2的底物,总体作用强度不及达格列净;体外实验显示,葛根素可较强抑制hSGLT2,最大效应为84％左右,半数抑制浓度(IC50)为0.40μtmol/L;OGTT结果显示,葛根素10、30、60和120 mg/kg剂量的抑糖率分别为5.1％、6.5％、16％和22％,呈剂量相关性;在UGE实验中,随着葛根素剂量的增大,尿糖量增加,与模型组比较,30、60和120 mg/kg剂量组差异显著(P＜0.05、0.01).结论 葛根素具有抑制hSGLT2、促尿糖降低血糖的药理活性,有可能作为一类新型结构的SGLT2抑制剂的先导化合物.

目的 分析不同启动子与核基质结合区(MAR)组合对中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中转基因表达的影响.方法 将β-珠蛋白MAR(gMAR)与人巨细胞病毒早期启动子(CMV-IE)、猿猴空泡病毒40(SV40)启动子组合,构建两种不同启动子与gMAR组合的表达载体.转染CHO细胞,48 h后观察增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的瞬时表达情况;G418筛选稳定转化的细胞株,流式细胞术分析稳定CHO细胞eGFP基因的表达水平,实时荧光定量PCR(qPCR)分析eGFP基因的相对拷贝数.结果 不含gMAR的表达载体,CMV-IE启动子eGFP表达明显强于SV40启动子;gMAR能提高CMV-IE启动子eGFP表达水平,但在SV40启动子中并未表现出提高作用.两侧含gMAR的表达载体比一侧含有gMAR的表达载体CMV-IE启动子eGFP表达荧光强;G418加压筛选后,含SV40启动子的gMAR表达载体eGFP基因表达不稳定,荧光逐渐减弱,因此,后期只对稳定表达eGFP基因的CMV-IE启动子表达载体进行流式细胞术和qPCR分析.流式细胞术检测结果显示,一侧含有与两侧含有gMAR的CMV-IE启动子表达载体eGFP基因表达量比不含gMAR的表达载体分别提高9.85倍和12.94倍;qPCR结果显示,以不含gMAR的载体的eGFP基因拷贝数为1,一侧含有与两侧含有gMAR的CMV-IE启动子表达载体eGFP基因相对拷贝数为3.68和9.25.结论 CMV-IE启动子活性强于SV40启动子;gMAR能提高CMV-IE启动子外源基因的表达水平,其机制可能与增加基因拷贝数相关.