目的:通过成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建HMGB2基因敲除的小鼠巨噬细胞株(Raw264.7)，并验证肺炎克雷伯菌(KP)感染后HMGB2敲除细胞介导促炎因子产生和杀菌能力的变化。方法:针对小鼠HMGB2基因靶向设计向导RNA(sgRNA)，将插入sgRNA的pX459质粒转染Raw264.7细胞，利用抗性筛选和有限稀释法获得HMGB2基因敲除细胞克隆。利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)对所获细胞克隆的HMGB2基因和蛋白表达进行鉴定。通过细菌计数测定HMGB2 －/－ Raw264.7吞噬和杀伤细菌能力，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HMGB2 －/－ Raw264.7促炎因子分泌情况。组间比较采用 t检验。 结果:利用嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株，HMGB2蛋白在敲除细胞株中完全不表达，HMGB2敲除后对KP的吞噬与正常细胞比较，差异无统计学意义(2.37±0.31比2.33±0.15， t＝0.17， P>0.05)，但感染后18 h胞内细菌存活比例显著高于正常细胞[(67.67±9.02)%比(32.33±6.11)%， t＝5.62， P<0.01]；KP感染HMGB2 －/－ Raw264.7，促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6分泌量显著低于正常细胞[(54.00±18.08) pg/ml比(111.70±8.50) pg/ml， t＝5.00， P<0.01；(65.67±9.87) pg/ml比(128.00±30.61) pg/ml， t＝3.36， P<0.01；(72.67±9.07) pg/ml比(95.00±5.29) pg/ml， t＝3.68， P<0.05]。 结论:通过CRISPR/Cas9技术成功构建HMGB2基因敲除Raw264.7细胞株，验证了HMGB2对诱导相关炎性因子及抗KP感染的影响。

目的:探究克罗恩病患者抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体(简称单抗)治疗中发生原发性失应答(PNR)的独立危险因素并构建预测模型。方法:纳入2018年12月1日至2022年7月31日于武汉大学人民医院行抗TNF-α单抗治疗的103例克罗恩病患者(建模组)，选择武汉大学中南医院同期行抗TNF-α单抗治疗的109例克罗恩病患者(验证组)。收集所有患者首次行抗TNF-α单抗治疗前的基线临床资料，包括C反应蛋白(CRP)、简化克罗恩病活动指数(CDAI)、克罗恩病改良乘数简化内镜评分(MM-SES-CD)等。采用多因素logistic回归分析筛选克罗恩病患者抗TNF-α单抗治疗中发生PNR的独立危险因素并构建列线图预测模型。通过比较受试者操作特征曲线(ROC)的曲线下面积(AUC)，计算净重新分类指数(NRI)、综合判别改善指数(IDI)，以及决策曲线分析(DCA)评估预测模型的预测效能和临床应用价值。统计学方法采用DeLong检验。结果:多因素logistic回归分析显示，基线CRP较高[ OR＝1.030，95%置信区间(95% CI) 1.002~1.059]、高简化CDAI( OR＝1.399，95% CI 1.023~1.913)和高MM-SES-CD( OR＝1.100，95% CI 1.025~1.181)为克罗恩病患者抗TNF-α单抗治疗中发生PNR的独立危险因素( P＝0.033、0.036、0.008)。ROC分析显示，CRP、简化CDAI、MM-SES-CD、预测模型在建模组和验证组的AUC分别为0.697(95% CI 0.573~0.821)、0.772(95% CI 0.666~0.879)、0.819(95% CI 0.725~0.912)、0.869(95% CI 0.786~0.951)、0.856(95% CI 0.756~0.955)，预测模型在建模组的AUC大于CRP和简化CDAI，差异均有统计学意义( Z＝3.00、2.75， P＝0.003、0.006)，与MM-SES-CD和验证组比较，差异均无统计学意义(均 P>0.05)；但建模组预测模型相对MM-SES-CD的NRI与IDI分别为0.205(95% CI 0.002~0.409， P＝0.048)和0.098(95% CI 0.022~0.174, P＝0.011)，提示预测模型的预测能力较MM-SES-CD更佳。DCA显示，预测模型在建模组和验证组中均有较大的临床获益。 结论:基于克罗恩病患者抗TNF-α单抗治疗中发生PNR的独立危险因素成功构建了预测模型，经验证，该预测模型具有良好的预测效能和较大的临床获益。

表皮生长因子受体(EGFR)在多种恶性肿瘤的发生、发展中有重要作用，目前针对EGFR的分子靶向治疗方兴未艾。分子影像可在体揭示EGFR表达状态与突变情况，可利用核素标记靶向EGFR的分子探针进行显像，其中以 11C标记酪氨酸激酶抑制剂研究为主。利用PET对EGFR表达与突变情况在体可视化，可无创筛选适合靶向治疗的患者及评价疗效。该文对上述探针的临床研究及临床试验进行综述，总结其临床价值，为未来进一步转化和应用提供依据。

目的:探讨治疗前 18F-脱氧葡萄糖(FDG) PET/CT摄取异质性在人表皮生长因子受体2(HER2)阳性转移性乳腺癌靶向治疗效果预测中的作用。 方法:回顾性分析2012年5月至2018年4月复旦大学附属肿瘤医院的29例HER2阳性转移性乳腺癌患者[均为女性，中位年龄52(32～69)岁]临床、病理及治疗前 18F-FDG PET/CT影像资料，患者均接受曲妥珠单克隆抗体(简称单抗)一线治疗。对患者进行中位时间35(6～87)个月的随访。分析临床、病理相关特点及PET/CT代谢参数与患者无进展生存期(PFS)、总生存期(OS)之间的关系。通过Cox单因素分析筛选变量，将 P≤0.01的变量纳入多因素Cox比例风险回归模型进行分析。采用时间依赖性受试者工作特征(ROC)曲线评价Cox回归模型的预测效能。生存曲线依据Kaplan-Meier法绘制，采用log-rank检验进行比较。 结果:29例患者中位OS为30(6～83)个月，中位PFS为10(2～29)个月。单因素分析结果示PET/CT瘤间摄取异质性指数，包括最大标准摄取值(SUV max)最高病灶与最低病灶的SUV max比值[SUV max-R；风险比( HR)＝8.6(95% CI: 2.7～27.8)， P<0.001]、平均标准摄取值(SUV mean)-2.5[标准摄取值(SUV)阈值为2.5]比值[SUV mean-2.5-R； HR＝2.6(95% CI：1.2～5.9)， P＝0.020]、肿瘤代谢体积(MTV)-2.5比值[MTV-2.5-R； HR＝2.4(95% CI：1.1～5.2)， P＝0.030]和总病灶糖酵解量(TLG)-2.5比值[TLG-2.5-R； HR＝3.2(95% CI：1.4～7.4)， P＝0.008]均与PFS有关，但与OS均无明显关系(均 P>0.05)。多因素分析结果显示SUV max-R为影响PFS的独立危险因素[ HR＝6.8(95% CI: 1.8～26.1)， P<0.01]。SUV max-R的ROC曲线下面积为0.747，以1.8作为界值，SUV max-R可以有效地区分曲妥珠单抗受益与非受益人群(PFS：15.0与7.0个月； χ2＝18.68， P<0.01)。 结论:PET/CT瘤间摄取异质性指数SUV max-R是HER2阳性转移性乳腺癌患者靶向治疗的独立预后因素，能够早期预测靶向治疗效果。

目的:制备人乳头瘤病毒6型L1(HPV6 L1)蛋白特异性单克隆抗体，探索抗体的结合特点、交叉活性以及中和效果。方法:从免疫HPV6 L1蛋白小鼠脾细胞中提取抗体基因，构建ScFv噬菌体抗体文库。用HPV6 L1蛋白对文库进行富集筛选，将获得的抗体基因表达成鼠IgG后，验证抗体与L1蛋白的结合性质以及对假病毒的中和效果。结果:成功构建了针对HPV6 L1的ScFv抗体文库，库容量为6.54×10 7。抗体文库经HPV6 L1筛选后获得了两株抗体，命名为Q9和Q11。经ELISA检测，Q9-IgG与HPV6 L1反应的滴度约为10 6，与HPV18和45 L1的滴度为10 2。Q11-IgG与HPV6 L1结合的滴度约为4×10 4，而与其他型别L1均不结合。经过假病毒中和试验测定，Q9-IgG没有中和活性，而Q11-IgG针对HVP6假病毒的中和滴度约为10 4.5。 结论:Q9和Q11均为HPV6 L1特异性单克隆抗体，但二者交叉反应性、抗原识别位点及中和活性均具有明显差异。该抗体可为HPV6病毒的基础研究、免疫学诊断以及治疗制剂研发提供工具抗体。

目的:制备新型冠状病毒野生株(WT)、Beta变异株、Delta变异株、Omicron变异株(BA.2、BA.5、BQ.1和XBB.1分支)等7株单克隆病毒株，用于申请国家标准株。方法:利用蚀斑纯化技术感染Vero细胞后筛选单克隆毒株，通过观察细胞病变特性与病毒形态学特征、病毒滴度与全基因组序列测定、支原体检测等方法，以评价单克隆毒株的基础生物学特征。结果:WT株、Beta变异株、Delta变异株、Omicron变异株(BA.2、BA.5、BQ.1和XBB.1)7株病毒感染细胞后，细胞病变表现为细胞圆缩脱落；蚀斑纯化后的病毒支原体检测均为阴性，2代至5代的病毒滴度在10 5～10 8 TCID 50/ml之间；电镜下病毒颗粒呈圆形或者椭圆形，直径在60～140 nm之间；全基因组测序与系统进化分析明确了7种毒株的变异株类别，证实了单克隆毒株连续传代5代基因组特征稳定。 结论:制备7种代表性新型冠状病毒变异株的克隆株，具有典型冠状病毒细胞病变效应、形态结构清晰、病毒活性良好、遗传稳定等特性，可作为候选毒株用于申请国家标准株。

目的:探讨miRNAs介导的胶质瘤肿瘤微环境(TME)中巨噬细胞(Mφ)的恶性转化及其机制。方法:应用集落刺激因子诱导表达绿色荧光蛋白(GFP)的小鼠骨髓来源细胞(BMDCs)分化，获得Mφ-GFP。将胶质瘤干细胞(GSCs)与Mφ-GFP体外共培养，筛选具备无限增殖潜能的Mφ-GFP，即恶变巨噬细胞(t-Mφ)。通过miRNAs芯片分析获取t-Mφ与正常Mφ的miRNAs差异表达谱。分别比较目标miRNA在中国脑胶质瘤基因组图谱计划(CGGA)不同世界卫生组织(WHO)分级胶质瘤组织、来源于手术切除的10例胶质瘤组织与瘤旁组织、t-Mφ与正常Mφ中的表达水平，并分析目标miRNA表达水平与患者生存期的相关性。采用流式细胞术、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹法(WB)及荧光素酶活性实验探讨目标miRNA调控TME中Mφ恶变的分子机制。结果:通过建立双色荧光示踪共培养体系，成功获得具备无限增殖潜能的单克隆GFP +细胞，并表达Mφ标志物F4/80和CD11b。miRNAs芯片差异表达谱和qRT-PCR结果证实，与正常Mφ相比，miR-223-3p在t-Mφ中的表达显著升高。临床分析中，胶质瘤组织样本中miR-223-3p的表达水平显著高于配对的瘤旁组织( P<0.01)。对CGGA的分析结果发现，胶质母细胞瘤中的miR-223-3p表达水平显著高于低级别胶质瘤(WHO 2/3级)( P<0.001)。生存分析结果提示，低表达miR-223-3p胶质瘤患者的总体生存期显著优于高表达组( P<0.01)。下调miR-223-3p可促进t-Mφ的凋亡( P<0.01)。生物信息学分析显示，受体相互作用蛋白激酶(RIPK3)基因3′-UTR区存在miR-223-3p潜在的结合位点。荧光素酶活性实验结果显示，与共转染miR-223-3p模拟物对照和RIPK3-WT的细胞相比，共转染miR-223-3p模拟物和RIPK3-WT的t-Mφ细胞荧光强度显著降低( P<0.01)。qRT-PCR和WB实验结果证实，miR-223-3p下调的t-Mφ中RIPK3的表达水平显著高于对照组( P<0.01)，而miR-223-3p过表达的t-Mφ中RIPK3的表达水平显著低于对照组( P<0.05)。此外，miR-223-3p抑制剂/RIPK3抑制剂组t-Mφ的凋亡细胞比例显著低于miR-223-3p抑制剂组( P<0.01)。 结论:GSCs可诱导TME中Mφ的恶性转化，而miR-223-3p可靶向抑制t-Mφ中RIPK3的表达，进而抑制t-Mφ的细胞凋亡。

目的:选取人慢性髓系白血病(CML)细胞K562为实验对象，利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除舌癌耐药相关蛋白1(TCRP1)基因的CML细胞系K562/TCRP1-KO，通过细胞增殖、细胞凋亡、药物敏感性等功能试验比较K562/TCRP1-KO与对照细胞(K562/cas9-CTL)的表型差异，初步探讨TCRP1基因参与CML发病的可能机制。方法:在特定位点设计针对TCRP1的小向导RNA(sgRNA)，寡核苷酸片段退火后与线性化的Cas9表达载体重组，慢病毒包装系统转染293T细胞，收集纯化病毒感染K562细胞，嘌呤霉素加压筛选阳性多克隆，有限稀释法进一步筛选出单克隆K562/TCRP1-KO，Sanger测序和Western blot检测成功敲除的稳定细胞株，同时构建转染lentiCRISPR载体的K562细胞作为对照细胞株(K562/cas9-CTL)，采用细胞计数法、CCK8法及伊马替尼(IM)梯度稀释法、流式细胞术分别对K562/TCRP1-KO和K562/cas9-CTL进行细胞增殖、药物敏感性及细胞凋亡分析。结果:成功构建了用于TCRP1敲除的sgRNA-Cas9重组质粒载体，转染293T细胞后，利用有限稀释法成功筛选到TCRP1敲除的单克隆细胞株。与K562/cas9-CTL细胞相比，K562/TCRP1-KO细胞的增殖能力显著减弱，IM药物敏感性显著增强，细胞凋亡进程显著加快(均 P<0.05)。 结论:利用CRISPR/Cas9成功构建了TCRP1敲除的CML细胞株，TCRP1可能作为癌症相关基因影响CML细胞的增殖、IM耐药能力及凋亡进程。

目的:构建表达报告基因荧光素酶和肿瘤相关抗原间皮素(mesothelin，MSLN)基因的胰腺癌细胞系，评估其作为靶细胞在评价免疫细胞的肿瘤杀伤效力中的应用。方法:构建表达荧光素酶、MSLN基因的慢病毒载体，包装慢病毒，感染胰腺癌细胞系，抗生素筛选后，有限稀释法获得单细胞克隆，并验证目的基因的稳定表达。实时无标记细胞分析(real-time cell analysis，RTCA)和荧光素酶活性检测方法体外检测免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效力。将构建的细胞系接种B-NDG小鼠建立表达荧光素酶的胰腺癌肿瘤模型，利用活体成像技术检测荧光素酶表达水平，监测小鼠体内胰腺癌肿瘤生长情况。在胰腺癌小鼠模型中验证嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T，CAR-T)细胞的肿瘤杀伤能力。结果:本研究建立了稳定表达荧光素酶和MSLN基因的胰腺癌细胞系panc-1-luc、panc-1-luc-MSLN和capan-2-luc细胞。3种细胞的报告基因表达水平较高，与细胞数量呈正相关，panc-1-luc-MSLN细胞的MSLN阳性率达95.6%。体外肿瘤细胞杀伤试验结果表明MSLN-CAR-T细胞能特异性杀伤MSLN抗原阳性的panc-1-luc-MSLN细胞和capan-2-luc细胞，最小杀伤率分别为(70.00±18.19)%和(57.00±5.29)%，而对MSLN阴性的panc-1-luc细胞无杀伤作用。RTCA结果显示MSLN-CAR-T细胞对构建的3种胰腺癌细胞均有杀伤能力，最小杀伤率分别为(56.33±7.64)%、(93.00±2.65)%和(26.33±28.15)%；NK-92MI细胞对靶细胞的杀伤不受MSLN限制。免疫缺陷小鼠胰腺癌模型结果显示，体内杀伤效力与体外荧光素酶活性检测结果一致。体内外试验证明，检测靶细胞荧光素酶表达活性，可以反映免疫细胞对靶细胞的杀伤效力。结论:本研究建立了稳定表达荧光素酶的多株胰腺癌单克隆细胞系，可用于体内外免疫治疗产品肿瘤杀伤效力的研究评价。

目的:应用CHO细胞表达系统表达重组水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)gE Δ-Fc融合蛋白，为筛选重组带状疱疹疫苗候选抗原提供参考。 方法:将含有编码gE Δ-Fc基因的真核表达质粒转染CHO细胞，经MSX加压筛选和有限稀释法挑选单克隆，获得分泌表达gE Δ-Fc融合蛋白的CHO细胞株。MabSelect SuRe亲和层析纯化gE Δ-Fc融合蛋白，ELISA法对gE Δ-Fc融合蛋白与Fc受体结合进行鉴定，流式细胞术检测DC2.4细胞对抗原的吞噬效果。gE Δ-Fc融合蛋白免疫BALB/c小鼠后，ELISA法检测小鼠血清抗体效价。 结果:获得表达gE Δ-Fc融合蛋白的CHO细胞株；流式细胞术证明DC2.4细胞对gE Δ-Fc融合蛋白的吞噬强于gE；gE Δ-Fc融合蛋白可以诱导BALB/c小鼠产生高滴度的抗VZV抗体。 结论:应用CHO细胞表达的重组VZV gE Δ-Fc融合蛋白具有较好的免疫原性。本研究为筛选重组带状疱疹疫苗候选抗原提供了数据支持。