目的 采用Plackett-Burman实验和响应面法(response surface methodology,RSM)优化酵母源无血清培养基(serum-free medium,SFM)的营养组分,明确培养基成分及浓度.方法 以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为研究对象,在实验室前期筛选出的SFM的基础上,采用Plackett-Burman实验对10种营养组分进行筛选.筛选出对细胞具有促生长作用的因素后,利用RSM进行二次优化,以阐明各变量间的相互作用,确定促CHO细胞生长的最佳培养基组成.取对数生长期CHO细胞,用优化后的培养基重悬后,进行传代扩增.结果 经Plackett-Burman实验筛选的10个变量中,酵母抽提物(yeast extract,YE)FM888和微量元素能有效提高细胞比生长速率;非必需氨基酸和FM888对提高细胞存活天数作用显著;FM888、必需氨基酸、非必需氨基酸及微量元素能显著提高活细胞密度.综合选择FM888、微量元素和非必需氨基酸3个因素进行RSM优化试验.优化后的培养基悬浮培养CHO细胞时,其最大比生长速率可达0.025/h,存活天数可达6 d,最大活细胞密度可达7.187 × 106个/mL.将优化后的培养基进行细胞稳定传代试验,可稳定传代12代,其活细胞密度及细胞活率与对照组(商业化SFM)接近.结论 成功获得成分明确且能支持CHO细胞高密度生长的酵母源SFM,为YE在动物细胞培养中的应用以及高效SFM的开发提供了参考和依据.

目的:建立尿酸盐沉积果蝇模型并确定其造模条件,并初步观察菊苣提取物抗尿酸盐沉积的作用.方法:以5％酵母提取物饲喂诱导果蝇尿酸盐沉积,通过果蝇马氏小管及后肠偏振光成像、六胺银染色及其匀浆液尿酸水平评价果蝇尿酸盐沉积状态,考察雌雄性别、不同造模时间对果蝇尿酸盐沉积的影响,并应用该模型研究菊苣提取物抗尿酸盐沉积的作用.结果:5％酵母提取物饲喂可成功诱导果蝇尿酸盐沉积;雄性果蝇在造模3 d后开始出现尿酸盐沉积,在造模7 d后大部分出现尿酸盐沉积,各造模时间点果蝇马氏小管及后肠匀浆液尿酸水平持续升高,各造模时间点之间差异不明显;雌性果蝇在造模10 d后开始出现尿酸盐沉积,在造模14 d后大部分出现尿酸盐沉积,各造模时间点果蝇马氏小管及后肠匀浆液尿酸水平持续升高,马氏小管及后肠匀浆液尿酸水平持续升高,各造模时间点之间比较,差异有统计学意义(P＜0.001);菊苣提取物可减少果蝇马氏小管及后肠偏振光信号,并明显降低其匀浆液的尿酸水平(P＜0.001).结论:以5％酵母提取物饲喂雌性果蝇14 d可较稳定诱导尿酸盐沉积,菊苣提取物可在果蝇模式动物上发挥抗尿酸盐沉积的作用.

目的 克隆三叶崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum查耳酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)基因,探究 CHI基因对三叶崖爬藤黄酮合成途径的调控作用.方法 分析三叶崖爬藤转录组,获得三叶崖爬藤CHI基因序列,并进行生物信息学分析.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定三叶崖爬藤根、茎、块茎、老叶、幼叶及吲哚-3-乙酸(3-indoleacetic acid,IAA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、水杨酸(salicylic acid,SA)和酵母提取物(yeast extract,YE)等诱导条件下CHI基因的表达量,利用分光光度法测定黄酮含量和CHI酶活性变化,并对其进行相关性分析.结果 转录组数据分析结果表明,三叶崖爬藤CHI基因全长为1096bp(GenBank序号:OQ588006),含有1个长为714bp的开放阅读框,编码237个氨基酸.三叶崖爬藤CHI蛋白分子式为C1148Hi819N285O348S5,等电点(PI)为5.28,相对分子质量为25 340,编码的氨基酸全都在膜外,不具跨膜结构,也不存在信号肽.三维空间结构分析表明,三叶崖爬藤CHI蛋白呈明显的倒置三明治状折叠结构,属于Chalcone-3超基因家族.进化树分析结果表明,三叶崖爬藤CHI蛋白序列与葡萄科植物亲缘关系最近.qRT-PCR结果表明,三叶崖爬藤CHI基因在三叶崖爬藤根、茎、块茎、老叶和幼叶等不同组织中均表达.诱导分析结果表明,5种外源诱导物质均提高了三叶崖爬藤黄酮含量,ABA诱导后CHI基因表达水平在72h达到最高,其余诱导处理CHI基因表达量均在96h达到最高,CHI酶活性均在96h达到最高.相关性分析结果表明,三叶崖爬藤黄酮含量与CHI基因表达量不存在显著相关性,与CHI酶活性存在极显著正相关(R2=0.453).结论 成功克隆了三叶崖爬藤CHI基因,该基因在三叶崖爬藤各组织中均表达.IAA、MeJA、ABA、SA和YE均促进CHI基因表达及酶活性的上升,在转录和翻译水平上调控三叶崖爬藤黄酮合成.

目的 通过对比生姜水提和绞汁两种提取物药理作用和化学成分的差异,从而研究生姜的药效物质基础以及为指导生姜临床上的合理应用提供科学依据.方法 采用酵母致热的大鼠模型,比较生姜水提和绞汁两种提取物的解热作用差异;采用二甲苯致小鼠耳肿胀模型,比较生姜水提和绞汁两种提取物的抗炎作用差异;通过对比生姜水提和绞汁两种提取物对DPPH自由基清除能力的大小,从而比较其抗氧化作用的差异.采用高效液相色谱法,测定生姜水提和绞汁两种提取物中6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的含量;采用紫外分光光度法,测定生姜水提和绞汁两种提取物中总多糖的含量;采用BCA蛋白浓度检测法(bicinchoninic acid)测定生姜水提和绞汁两种提取物中总蛋白的含量.结果 生姜水提物对酵母致热的大鼠模型体温改善作用不明显(P＞0.05),而生姜绞汁提取物能显著改善酵母致热的大鼠模型(P＜0.05);生姜水提物对二甲苯导致小鼠耳肿胀的模型具有显著的改善作用(P＜0.05),而生姜绞汁提取物的改善作用不明显(P＞0.05);阳性对照药物维生素C、生姜水提物和生姜绞汁提取物对DPPH自由基清除率分别为79.68％、78.36％和76.52％;生姜水提物中的6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚含量分别为0.259 6 mg/g,0.027 18 mg/g和0.026 79 mg/g,生姜绞汁中的6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的含量分别为0.161 3 mg/g、0.020 82 mg/g和0.034 99 mg/g;生姜水提物和生姜绞汁提取物中总多糖含量分别为1.790 mg/g和1.390 mg/g;生姜水提物和生姜绞汁提取物中总蛋白含量分别为9.90 mg/g和7.840 mg/g.结论 生姜水提物的解热作用不及生姜绞汁提取物,但生姜水提物的抗炎作用要明显优于生姜绞汁提取物,生姜水提物和生姜绞汁提取物均具有明显的抗氧化作用.因此,生姜临床应用时,发挥其解热作用时应选用其绞汁提取物,发挥其抗炎作用时可选用其水提物,发挥其抗氧化作用时两种提取物均可.生姜水提物中6-姜酚、8-姜酚、总多糖和总蛋白的含量比生姜绞汁提取物相对较多,而10-姜酚的含量比生姜绞汁提取物相对较少,两种提取物化学成分含量的差异是其不同临床应用的物质基础.

目的:寻找与柴胡解表退热功效相关的生物活性指标,并探明此功效的生物活性量化值与柴胡皂苷a(SSa)和柴胡皂苷d(SSd)含量是否具有相关性.方法:采用临床煎药方式获得柴胡水煎液,并通过醇沉去除多糖和蛋白质等大分子物质,得到适宜体外实验的柴胡提取物.从抗炎、抗过敏、抗氧化应激及解热这4类与柴胡解表退热功效相关的体外模型中筛选量效关系明确的生物活性指标,并赋予各项指标不同的权重系数,对7个柴胡样品在各项指标上的作用强弱进行排序打分;分数与相应指标权重的积为该项得分;每项得分之和为该样品解表退热之生物活性量化值;采用CCK-8法检测细胞活力;Griss法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)水平;ELISA法测定细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及补体活化水平;铁离子还原能力法(FRAP)测定总抗氧化能力;高效液相色谱法测定柴胡中的SSa和SSd含量.结果:筛选得到4项关联柴胡解表退热功效的量效关系明确的生物活性指标,分别为脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞分泌NO、LPS诱导THP-1细胞分泌TNF-α、总抗氧化能力及酵母多糖介导的替代途径补体活化.相关性分析显示,7个样品的SSa和SSd总量与解表退热的生物活性量化值不相关.结论:柴胡解表退热可能与其抑制促炎因子(NO)生成、压制内生性致热原(TNF-α)生成、抗氧化及抗补体C5a活化有关,而《中华人民共和国药典》2020年版柴胡指标性成分SSa和SSd可能并非柴胡该功效的物质基础.

利用酵母提取物(yeast extract,YE)作为模拟生物胁迫的诱导子,诱导花楸悬浮细胞(Sorbus pohuashanensis suspension cell,SPSC)产生生物胁迫作用,对胁迫下产生的三萜类次生代谢产物进行分离鉴定.采用正相硅胶、葡聚糖凝胶、中压制备液相等色谱技术对SPSC甲醇提取物进行分离纯化,并运用波谱分析技术鉴定出 26 个三萜类化合物,包括 15 个乌苏烷三萜(1～15),2 个 18,19-裂环乌苏烷三萜(16～17),4 个羽扇豆烷三萜(18～21),2 个环阿屯烷三萜(22～23),以及 3 个鲨烯型三萜(24～26).所有三萜均为首次从YE诱导SPSC中分离得到,其中化合物 22-O-acetyltripterygic acid A(1)为新化合物.对分离得到的化合物进行抗真菌、抗肿瘤和抗炎活性评估,结果表明化合物 1 对脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7 释放一氧化氮(NO)具有一定的抑制作用.

[背景]白术是十分重要的大宗药材之一,在其种植过程中一直受到土壤肥力不足导致农药化肥大量施用的困扰.[目的]从白术中分离纯化出对白术生长发育具有促进作用的微生物,为白术生物肥料的制备提供材料基础.[方法]采用钼锑抗比色法和Salkowski比色法等测定菌株溶解无机磷和产吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)的能力;使用灌根法测定供试菌株对植株生长发育的影响;通过形态学和生理生化的方法,结合 16S rRNA基因测序技术对供试菌株进行分类鉴定;使用响应面法优化菌株的培养条件.[结果]分离获得一株对白术具有促生作用的菌株BZ-8,解磷能力和产IAA能力可达到 4.89 mol/L和 45.52 μg/mL,16S rRNA基因测序长度 1 363 bp,系统发育树分析确定菌株BZ-8 为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens);菌株发酵液对白术苗期的生长有明显的促进作用;优化后的发酵培养条件为(g/L):麦芽糖 5.0,牛肉膏 3.0,酵母提取物 5.0,胰蛋白胨 10.0,柠檬酸钠 5.0,培养基初始pH 7.01,培养温度 30.4℃,摇床转速 180 r/min.[结论]白术内生菌粘质沙雷氏菌BZ-8 能够解磷和产IAA,对白术具有明显的促生作用,本研究确定了菌株BZ-8 的培养条件.

目的 探究RNA干扰(RNAi)机制中Argonaute(Ago)基因和RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)基因在黄曲霉生长发育中的作用.方法 利用同源重组的方法构建黄曲霉Ago1、Ago2、RDRP1、RDRP3基因突变菌株,接种106 CFU/mL孢子悬液3 μl至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养基上观察突变菌株的生长发育现象.在小量酵母提取物葡萄糖(YGM)培养基中加入200μg、400μg细胞壁压力试剂刚果红(CR),0.8M、1.6M渗透压药物氯化钠(Nacl),氧化压力试剂2mM、4mM过氧化氢(H2O2),基因组损伤剂0.01％、0.02％甲磺酸甲酯(MMS)试剂分析突变菌株的压力应激反应.结果 成功构建黄曲霉突变菌株△Ago1、△Ago2、△RDRP1、△RDRP3且生长发育正常.△Ago1、△Ago2菌株相比对照可降低对细胞壁和渗透压的胁迫影响.Ago1基因缺失可降低H2O2的影响,相反RDRP3基因缺失,H2O2的抑制作用增加.△Ago2、△RDRP1菌株能降低对基因损伤剂的作用.此外,△RDRP1增加渗透压胁迫作用.结论 黄曲霉Ago1、Ago2、RDRP1、RDRP3基因不参与生长速率和无性繁殖调控,可以参与调节宿主菌对环境的应激反应.

Paraherquamide A(PA)作为新型驱虫药Startect?的重要原料,其产量制约药物的推广和使用.本研究采用响应面法系统对野生Penicillium sp.KWF31的PA发酵工艺进行优化.通过Plackett-Burman设计对培养基的8个因素进行筛选,得到显著影响效价的3个关键因素分别是酵母提取物、可溶性淀粉和葡萄糖.进而采用爬坡实验逼近这3个关键因素的最大响应区域,通过Box-Behnken设计建立数学模型,获得产PA的最佳条件为可溶性淀粉31.0 g/L、葡萄糖12.8 g/L、酵母提取物14.5 g/L.在此条件下,PA效价高达243.7 mg/L,与预测值241.6 mg/L相近,是优化前的3.4倍.

目的 考察生物诱导子酵母提取物(YE)和非生物诱导子银离子(Ag+)复合诱导子对不同处理时间丹参毛状根生长量和初次生代谢产物积累的综合性影响.方法 在继代培养21d的丹参毛状根中添加YE+Ag+复合诱导子,分别测定诱导后0、2、4、6、8、10 d后丹参毛状根的生长量,采用紫外分光光度法和超高效液相色谱法测定丹参毛状根体内初次生代谢产物的含量.结果 在实验浓度条件下,与空白对照组相比,YE+Ag+对毛状根生长有明显的抑制作用,且抑制了初生代谢产物总糖和总蛋白的积累.YE+Ag+明显促进了毛状根中次生代谢产物总酚酸类和总丹参酮类的积累,其中咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮I、丹参酮ⅡA和隐丹参酮含量分别为空白对照组的2.22、7.47、2.39、32.15、7.65和52.89倍.结论 YE+Ag+协同作用抑制丹参毛状根的生长,同时对不同成分的积累具有不同的影响,抑制初生代谢产物的积累,促进次生代谢产物的积累.