目的:探讨ATG5、ATG7基因对诱导多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226细胞发生铁死亡的敏感性的影响.方法:用CRISPR/Cas9技术敲除RPMI-8226细胞株中自噬关键基因ATG5和ATG7;Western blot法鉴定基因敲除细胞并检测自噬相关蛋白P62、LC3B的表达变化;流式细胞术检测基因敲除细胞对RSL3敏感性的变化;检测基因敲除细胞内亚铁离子含量和活性氧水平.结果:Western blot检测结果证实RPMI-8226细胞中ATG5、ATG7基因被成功敲除.流式细胞术检测结果显示,RPMI-8226细胞存活率与不同浓度RSL3呈剂量依赖关系(r=-0.969);用10 μmol/L的RSL3诱导对照组和基因敲除组细胞发生铁死亡,48 h后基因敲除组细胞存活率显著高于对照组(均P＜0.001).ATG5、ATG7基因敲除后,细胞内Fe2+的含量较对照组明显下降(均P＜0.01),活性氧水平亦明显下降(均P＜0.001).结论:敲除ATG5、ATG7基因可以抑制多发性骨髓瘤细胞发生铁死亡,LAP途径可能参与其调控.

目的:探究组蛋白甲基转移酶Kmt2c基因杂合缺失对小鼠血液系统的影响.方法:使用CRISPR/Cas9技术构建Kmt2c基因杂合缺失的模型小鼠,血常规连续监测小鼠全血细胞计数的变化;通过体外集落形成实验探究骨髓细胞的克隆性扩增能力;流式细胞术分析突变小鼠体内原始造血细胞群(长期造血干细胞、短期造血干细胞、多能祖细胞)的比例变化.结果:成功构建Kmt2e基因杂合缺失小鼠(Kmt2c+/-)模型,其Kmt2c mRNA表达水平是C57BL/6J小鼠的28％.Kmt2c+/-小鼠骨髓细胞体外集落形成能力随着传代次数的增加而增强,并在第四代时集落数显著高于对照组(P＜0.05).Kmt2c+/-小鼠原始造血细胞群中的长期造血干细胞和短期造血干细胞比例分别为19.6％±3.3％及28.9％±4.9％,较对照组的16.9％±2.6％及18.9％±2.5％有增高趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05).Kmt2c+/-小鼠的白细胞计数在监测的第12周后逐渐上升,在第14周时为(9.8±1.0)× 109/L,显著高于对照组的(7.3±1.4)×109/L(P＜0.05).结论:Kmt2c+/-小鼠的骨髓细胞具有克隆性扩增的潜能.

目的:发掘RNF213基因与急性髓系白血病(AML)的关联,并探究RNF213对AML细胞系THP-1细胞增殖及凋亡的影响.方法:通过GEPIA数据库分析RNF213基因在AML中的表达与预后的关系.收集2017年1月至2022年1月于遵义医科大学附属医院就诊的AML患者30例以及血液系统非肿瘤患者21例,采用RT-qPCR和Western blot法分别检测RNF213 mRNA及蛋白表达水平,Kaplan-Meier法对AML患者进行生存分析,同时检测AML细胞株(THP-1、OCI-AML2)中RNF213 mRNA及蛋白表达水平.采用CRISPR-Cas9技术敲减THP-1细胞中RNF213基因,流式细胞术检测细胞凋亡率,CCK-8和集落形成实验检测细胞增殖情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase 3的表达水平.结果:AML患者的RNF213基因表达水平明显高于对照组,且RNF213高表达患者的预后更差,THP-1细胞中RNF213蛋白表达水平也高于对照组.敲减THP-1细胞RNF213基因后,细胞增殖明显降低,细胞凋亡率及凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3的表达较对照组明显增加.结论:在AML患者中RNF213高表达,且高表达患者预后更差.RNF213基因影响AML细胞增殖及凋亡,可能是AML预后相关的标志物和潜在的治疗靶点.

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建SLC19A2基因敲除的纯合子小鼠模型,并验证其表型.方法 设计gRNA载体,将构建好的gRNA载体和Cas9载体进行体外转录后共注射到受精卵,经胚胎移植后获得6只(雌性3只、雄性3只)阳性F0代小鼠.通过繁育获得12只(雄性6只、雌性6只)SLC19A2基因敲除纯合子小鼠[SLC19A2-/-小鼠(C57BL/6)].8周龄野生型C57BL/6小鼠和SLC19A2-/-小鼠各12只(雄性6只、雌性6只),分别设为野生型组与基因敲除纯合子组.采用PCR扩增凝胶电泳法鉴定小鼠基因型;采用实时荧光定量PCR检测胰腺组织和肝脏组织中SLC19A2 mRNA表达,采用蛋白质印迹法检测胰腺组织和肝脏组织中THTR-1蛋白表达.结果 PCR扩增凝胶电泳法成功鉴定出SLC19A2-/-小鼠.基因敲除纯合子组胰腺组织和肝脏组织中SLC19A2 mRNA及THTR-1蛋白表达水平低于野生型组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 基于CRISPR/Cas9技术成功构建了 SLC19A2基因敲除小鼠.

目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（ P<0.001）、一步生长曲线（ P=0.001）、感染复数（ P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。

目的:探讨约瑟芬结构域含蛋白2（JOSD2）的表达对肾透明细胞癌增殖与迁移的影响。方法:在Timer、UALCAN，数据库中分析JOSD2在肾癌中的差异表达和预后（ P<0.05）。在Caki-1细胞系中使用成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9技术导入shRNA敲低JOSD2。设置对照组和稳定JOSD2敲低组（sh1、sh2），通过细胞计数试剂盒（CCK-8）增殖实验、平板克隆实验、Transwell实验分别观察对细胞增殖、迁移能力的影响。采用独立样本 t检验进行组间比较。 结果:生信数据库发现JOSD2在多种肿瘤中异常高表达，其中包括肾透明细胞癌[28.707（22.825～36.424）比20.433（17.507～23.548）， P<0.05]。在敲低JOSD2后，CCK-8结果显示，JOSD2敲低后细胞增殖能力明显低于对照组（3.11±0.08比2.12±0.13， t＝14.64， P<0.05；3.10±0.08比2.18±0.20， t＝10.26， P<0.05）。平板克隆形成实验结果显示，JOSD2敲低后细胞集落形成能力显著低于对照组[（365.0±34.6）个比（217.0±22.0）个， t＝6.948 P<0.05；（365.0±34.6）个比（186.0±38.2）个， t＝7.216， P<0.05]。Transwell实验显示，JOSD2敲低后细胞迁移能力显著低于对照组[（1 234.5±85.1）个比（689.8±58.7）个， t＝10.540， P<0.05；（1 234.5±85.1）个比（635.0±112.3）个， t＝6.967， P<0.05]。 结论:JOSD2在肾癌中表达上调，敲低JOSD2能抑制肾癌细胞增殖和迁移。

成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种利用RNA指导核酸内切酶进行基因编辑的技术，具有操作简便、靶向精准、周期短、基因敲除效率高等特点，被广泛用于多个物种的基因编辑及疾病基因治疗中。目前，采用该技术已构建了多种眼科疾病动物模型，如角膜营养不良模型( UBIAD1、 TGF- β R124C基因突变)、青光眼模型( MYOC Y435H、 OPTN E50K和 PMEL基因突变)、白内障模型( GJA8、 KPNA4、 c- Maf、 AQP5和 PIKFYVE基因突变)、Leber先天性黑矇动物模型( KCNJ13和 LCA5基因突变)、视网膜母细胞瘤动物模型( RB1/ RBL基因突变)和视网膜色素变性动物模型( HKDC1、 C8ORF37、 CERKL、 PRCD、 ASRGL1、 LRAT和 PDE6B基因突变)等。还有研究者采用该基因编辑技术进一步证实了 MFRP、 CPAMD8、 Pax6和 FREM基因在动物眼部发育过程中的作用。本文就CRISPR/Cas9基因编辑技术在构建眼科疾病动物模型中的应用进行综述。

目的:初步探索ras相关C3肉毒杆菌毒素底物3（RAC3）在1型糖尿病（T1DM）和树突状细胞（DC）中的作用。方法:选取来自广东省T1DM转化医学研究中2011至2016年入组后规律随访的T1DM患者作为病例组，选择2011至2016年来自中山大学附属第三医院就诊的正常糖耐量者作为健康对照组。病例组和对照组均在筛选阶段进行全外显子组测序，在验证阶段进行基因分型。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建C57BL/6小鼠背景的RAC3全身敲除（KO）小鼠模型。使用聚合酶链反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western blotting法分别验证RAC3在DNA、RNA和蛋白水平是否被敲除。通过流式细胞染色检测RAC3 KO小鼠和同窝野生对照（WT）小鼠（每组3只）的DC分化比例以及主要组织相容性复合体Ⅱ类分子（MHC Ⅱ）、CD86和CD80等成熟活化指标的表达水平。采用logistic回归分析法比较病例组和对照组之间等位基因频率分布的差异。组间比较采用独立样本 t检验。 结果:筛选阶段共纳入72例T1DM患者和487名健康对照，验证阶段共纳入122例T1DM患者和577名健康对照。筛选阶段结果显示，T1DM患者中RAC3 rs4969478位点的等位基因T频率高于健康对照［分别为7.64%（11/144）和1.13%（11/974），OR=9.38， P<0.001］。验证阶段基因分型结果同样显示，T1DM患者中RAC3 rs4969478位点的等位基因T频率高于健康对照［分别为4.50%（11/244）和1.13%（13/1 154），OR=4.14， P<0.01］。WT小鼠和RAC3 KO小鼠的DC分化比例差异无统计学意义（分别为85.6%±1.1%和83.3%±0.25%， P=0.08）。WT小鼠和RAC3 KO小鼠DC中MHC Ⅱ、CD86和CD80等成熟活化指标的表达水平差异均无统计学意义（ P>0.05）。 结论:遗传学研究提示RAC3可能是人类T1DM的易感基因，但可能不通过DC参与T1DM的发生。

目的:研究人肝癌组织中S期激酶相关蛋白2（SKP2）表达与预后的关系以及肝癌细胞中SKP2表达对人肝癌细胞放射敏感性的影响。方法:使用TCGA数据库中肝癌组织和正常对照组织的测序结果，分析 SKP2基因在肝癌组织中的表达情况及其与患者预后的关系。使用Western blot检测肝癌细胞放射照射前后SKP2蛋白水平表达变化。利用CRISPR/Cas9技术敲除肝癌细胞 SKP2基因的启动子和第1外显子，建立 SKP2基因敲除的PLC/PRF/5和Hep3B肝癌细胞系模型，并进一步进行放射照射。用克隆形成实验检测 SKP2基因敲除细胞的放射敏感性变化情况。 结果:对TCGA数据库分析结果显示，与正常组织比较， SKP2基因在肝癌组织中表达升高。对 SKP2高、低水平肝癌患者总体生存率进行K-M法分析，结果显示 SKP2高表达肝癌患者预后相对较差，其5年生存率为34.6%， SKP2低表达肝癌患者则为50.6%（ HR=2.18，95% CI为1.46~3.27， P<0.001）。体外细胞实验显示肝癌细胞受到放射照射后SKP2表达水平明显升高。在CRISPR/Cas9敲除SKP2 -/-肝癌细胞中，克隆形成实验结果显示SKP2 -/-肝癌细胞的放射敏感性较SKP2 +/+明显增加。 结论:SKP2基因在肝癌组织中表达升高，且高表达者较低表达者预后差。放射可上调PLC肝癌细胞SKP2的表达水平，而敲除 SKP2后其放射敏感性明显增加。

目的:本研究旨在探讨蛋白酶体26S亚基非ATP酶7(PSMD7)表达对肾透明细胞癌增殖和迁移能力的影响。方法:利用临床生信之家数据库分析PSMD7在肾透明细胞癌中的差异表达。在人肾透明细胞癌皮肤转移细胞(Caki-1)细胞株中利用成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9技术导入短发夹RNA(shRNA)敲低PSMD7，设置组别为Caki-1对照组细胞株，稳定敲低PSMD7实验组的Caki-1细胞株(shPSMD7-1、shPSMD7-2)，以蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Caki-1细胞中PSMD7的敲低效率。通过细胞计数盒(CCK-8)增殖实验、平板克隆实验和Transwell实验评估实验组和对照组细胞增殖和迁移的能力。两组间比较采用独立样本 t检验。 结果:PSMD7在多种肿瘤中表达显著上调，其中包括肾透明细胞癌，肿瘤组织中PSMD7表达高于正常组织[5.70(4.13～7.29)比3.46(1.74～5.17)， P<0.05]。通过蛋白质免疫检测法检测敲低效率(1.36±0.05比0.43±0.07， t＝10.77， P<0.05；1.36±0.05比0.31±0.07， t＝12.53， P<0.05)；CCK-8结果显示，敲低PSMD7后，细胞增殖能力显著下降(1.32±0.91比0.67±0.49， t＝3.448， P<0.05；1.32±0.91比0.60±0.35， t＝3.222， P<0.05)。平板克隆形成实验显示，PSMD7敲低组细胞的增殖水平明显低于对照组[(792.0±24.0)个比(520.0±28.0)个， t＝7.376， P<0.05；(792.0±24.0)个比(518.0±30.0)个， t＝7.132， P< 0.05]。Transwell实验显示，PSMD7敲低组细胞的迁移能力明显低于对照组[(690.0±14.0)个比(237.5±33.5)个， t＝12.46， P< 0.05；(690.0±14.0)个比(176.5±13.5)个， t＝26.40， P< 0.05]。 结论:在肾癌组织中，PSMD7表达上调；敲低PSMD7表达可有效抑制肾癌细胞的增殖和迁移能力。