目的:聚乳酸（PLA）静电纺丝纤维与真皮脱细胞基质（ADM）结合制备适宜伤口愈合的敷料。方法:利用静电纺丝工艺制备不同质量浓度（10%、12%、14%）的聚乳酸（PLA）纤维膜，筛选出最佳浓度后测定一系列生物学性能。采用4%过氧化氢-6%氢氧化钠溶液浸泡法制备兔ADM，评价脱细胞程度。将纤维膜在质量浓度为5%的ADM溶液中孵育24 h，经干燥、辐照灭菌制成负载ADM的PLA纤维膜，评价生物相容性。动物实验：在新西兰兔背部皮肤制造急性创面研究纤维膜促进创面愈合的效果。结果:12%浓度PLA纤维膜性能最佳，平均孔隙率79.37%，纤维直径分布主要范围为0.4～1.0 μm，平均吸水率为550.484%，最大拉伸强度可达5.74 MPa，完全培养基孵育12周失重率为12.47%。制备的ADM无细胞残留，DNA残留量（47.528±0.419） ng/mg，与未脱细胞真皮比较，DNA去除率高达96.01%，脱细胞效果良好，差异有统计学意义（ t＝47.750， P<0.01）。细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测脂肪干细胞增殖能力，48 h复合纤维膜浸提液培养吸光度值（1.121±0.013）与完全培养基培养吸光度值（0.934±0.043）比较，差异有统计学意义（ t＝7.181， P<0.01），说明复合纤维膜生物相容性良好。且动物实验复合纤维膜覆盖创面收缩速度最快，14 d时复合纤维膜组相对伤口面积分别与PLA组、ADM组、纱布对照组比较，差异有统计学意义（ t＝5.908、15.540、23.640， P<0.01）。 结论:本研究制备负载ADM的PLA纤维膜性能良好，可促进兔表皮急性创面修复。

目的:人脂肪干细胞(hASCs)与软骨脱细胞基质(CAM)3D打印构建适合细胞生长的三维细胞生物支架。方法:从郑州大学第二附属医院10例抽脂患者的脂肪组织中提取脂肪干细胞进行体外培养，取第3代hASCs进行软骨诱导，用阿利新蓝染色检测hASCs的软骨分化。通过脱细胞方法对猪耳软骨进行脱细胞，后对脱细胞效果进行检测。利用制备的CAM和海藻酸钠(SA)按(CAM∶SA 7∶3、6∶4、5∶5、4∶6)进行混合，用3D打印机打印成个性化三维生物支架，通过细胞计数试剂盒(CCK-8)进行支架细胞毒性检测，对不同比例支架的生物学特性如孔隙率、力学性能、降解率进行比较，找出最优的支架混合比例。用上述最优比例接种hASCs(1×10 6个)行3D打印，三维细胞生物支架体外培养1周后在倒置显微镜下观察细胞存活情况。组间采用 t检验。 结果:hASCs传代后在显微镜下观察呈梭形、多角形，胞质丰富，胞核清楚。hASCs经软骨诱导剂诱导后，hASCs可向软骨分化。猪耳软骨经脱细胞后效果良好，内部无细胞残留，DNA残留量和未脱细胞软骨比较，差异有统计学意义( t＝65.420， P<0.05)。支架浸提液和完全培养液分别培养hASCs比较，培养后第2、4、6天时间点，细胞增殖数量比较，差异无统计学意义( t＝1.750、2.365、2.106、 P>0.05)。3D打印不同比例的支架，CAM含量越多，降解速率越快，力学强度和孔隙率越小。其中5∶5和4∶6混合比例形成的支架生物学性能更优。hASCs(1×10 6个)混合这两种比例支架经3D打印形成个性化三维支架，活死细胞染色显示，第3天和第7天时间点，5∶5支架混合的hASCs活细胞更多。细胞增殖比较，第3天和第7天时间点，5∶5支架混合的hASCs增殖数量多余4∶6比例组，差异有统计学意义( t＝4.350、4.922， P<0.05)。 结论:比例为5∶5的CAM-SA经3D构建的三维生物支架最适合细胞生长。

目的 建立150 L生物反应器大规模培养狂犬病病毒(rabies virus,RABV)的工艺,为后期开发更大规模高密度微载体反应器工艺奠定基础.方法 应用30 L(型号:C30-2)和150 L(型号:VESSEL FERMENTER 300L)生物反应器,以灌流方式培养Vero细胞和CTN-1V株RABV,Cytodex-1微载体浓度20g/L,培养温度36～38 ℃,DO 20％～60％,pH 7.0～7.4,连续13 d收获病毒液,培养过程中取样检测细胞密度、病毒滴度,并对病毒收获液进行无菌和支原体检查及抗原、宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、DNA残留量检测.结果 30和150 L生物反应器的细胞培养密度均可达1.2×107个/mL以上,在培养过程中各时间点的细胞密度差异均无统计学意义(t=0.225～2.173,P=0.096～0.833).2种规模生物反应器病毒收获液均在感染后6 d达最高病毒滴度(8.5 lgLD50/mL),且差异无统计学意义(t=1.000,P=0.374).2种规模生物反应器病毒收获液的抗原、HCP、BSA和DNA残留量基本一致.结论 可用150 L生物反应器大规模培养RABV,病毒收获液符合《中国药典》三部(2020版)相关标准.

目的:通过国家药品评价性抽检工作,了解市场上的巴戟天饮片质量及存在的问题,为巴戟天的质量标准提高和市场监管提供数据支持.方法:从全国24个省级行政区抽取巴戟天饮片,按照《中华人民共和国药典》2015年版(一部)巴戟天性状项和薄层鉴别项方法开展检验工作,并进行DNA条形码技术、指纹图谱、环烯醚萜含量测定、真菌毒素残留量共4项探索性研究,分析检验结果以评价巴戟天饮片的市场情况.结果:本次抽检的88家企业的巴戟天饮片共计108批,按照国家法定标准检验的合格率为100％.DNA条形码技术可以有效区分巴戟天及其混伪品.指纹图谱研究结果显示,正品巴戟天指纹图谱相似度均超过95％,混伪品相似度均低于70％.含量测定结果显示,不同巴戟天炮制品中环烯醚萜从种类和含量上具有显著性差别.真菌毒素筛查试验结果显示,有1批样品的黄曲霉毒素G1超出药典限度.结论:按标检验结果显示,市场上巴戟天饮片质量基本合格.根据探索性研究结果,建议标准增加环烯醚萜含量测定和黄曲霉毒素限量检查.

目的 建立NMM肿瘤DNA疫苗原液中乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na)残留量高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测方法,并进行验证,用于DNA疫苗质量控制.方法 将NMM肿瘤DNA疫苗原液与硫酸铜络合后,建立EDTA-2Na残留量HPLC检测方法:色谱柱为Agilent ZORBAXSB-C18(150mm×4.6mm,5μm);流动相为水-10％四丁基氢氧化铵-乙腈溶液(74.5∶0.5∶25);检测波长为254 nm;流速为0.8 mL/min;柱温为20 ℃;进样量为20 μL.对方法的专属性、线性范围、检测限及定量限、溶液稳定性、耐用性、准确度、精密度进行验证.用建立的方法对多批次DNA疫苗原液中EDTA-2Na残留量进行检测.结果 EDTA-2Na对照品及加入EDTA-2Na的DNA疫苗原液与硫酸铜反应后,在5.3 min附近出现吸收峰,而DNA疫苗原液与硫酸铜反应后未见吸收峰;对照品在4～400μg/mL范围内,与峰面积呈良好的线性关系,R2=0.999 9;该方法检测限为10 ng/mL,定量限为40 ng/mL;对照品及供试品溶液放置12 h,溶液稳定性良好;方法检测条件发生微小变动时(不同流动相比例、不同流速、不同柱温),对检测结果的影响在可接受范围内;低、中、高浓度加标样品EDTA-2Na回收率均值为101.38％,RSD为0.39％;0.1mg/mL对照品溶液连续进样6次,峰面积RSD为0.04％,6份供试品溶液均未检出EDTA-2Na,含EDTA-2Na的供试品溶液峰面积RSD为0.02％,中间精密度良好.多批次DNA疫苗原液均未检测出EDTA-2Na残留.结论 建立的方法操作简便,准确可靠,专属性强,可用于DNA疫苗原液中EDTA-2Na残留量检测.

目的 建立严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量荧光定量PCR检测方法,并进行验证,以期更好地控制产品安全性.方法 通过磁珠法对SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)原液进行DNA提取,采用探针型PCR对宿主细胞DNA残留量进行定量分析.对建立的方法进行线性范围、重复性、中间精密度、定量限、专属性、耐用性、准确度验证,并使用该方法对5批SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)进行宿主细胞DNA残留量检测.结果 DNA标准曲线在300～0.003 pg/μL范围内线性良好(R2均≥ 0.99);重复性和中间精密度验证相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均＜20％;定量限为0.001 pg/μL;样品稀释液与纯化液稀释液对检测无干扰;样品于53、55、57 ℃条件下孵育60 min及55 ℃条件下孵育56、60、64min的检测结果无明显差异;准确度验证回收率在79％～83％,RSD＜5％.用该方法检测SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)原液中DNA残留量适应性良好.结论 成功建立了 SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量荧光定量PCR检测方法,该方法线性范围、重复性、中间精密度、定量限、专属性、耐用性和准确度均符合可接受标准,适用于SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量的检测及质量控制.

目的 建立检测抗CD52单克隆抗体原液中残余DNA的方法,并对该方法进行验证.方法 利用CHO Host Cell DNA Extraction&Amplification Kit,采用qPCR法检测抗CD52单克隆抗体中宿主细胞残留DNA含量,并进行方法的专属性、线性、准确度、精密度和耐用性验证.结果 该方法可以准确定量检测CHO细胞残留DNA含量.专属性验证试验中对照制剂无特异扩增曲线,而CHO细胞上清有明显的扩增曲线;5次试验中标准曲线相关系数R2均≥0.98,表明该方法线性良好;准确度验证试验中所有试验的加标回收率均在70％～130％范围内;精密度验证试验中所有试验检测结果的相对标准偏差(RSD)均不大于30％;耐用性验证试验中,Proteinase K不同消化温度下检测结果的CV为0.85％,不同稀释倍数的供试品加标回收率在70％～ 130％范围内,不同稀释倍数外源DNA检测结果CV为4.71％.结论 该方法专属性、准确度、精密度、线性和耐用性均符合要求,可采用该试剂盒qPCR法检测外源DNA残留量.

目的 建立新型肝靶向干扰素(interferon-circumsporozoite protein,IFN-CSP)的质量标准.方法 采用细胞病变抑制法进行生物学活性测定;RP-HPLC法及非还原SDS-PAGE法进行纯度分析;BCA法、ELISA法、抗生素微生物学检定法、凝胶法分别测定蛋白质含量、宿主菌蛋白质残留量、氨苄青霉素残留量和细菌内毒素含量;紫外光谱法确定吸收峰位置;液质联用技术进行肽指纹图谱分析;Edman降解法检测N-端氨基酸序列.结果 IFN-CSP的生物学活性、纯度、蛋白质含量、宿主菌蛋白质残留量、氨苄青霉素残留量及细菌内毒素的检验结果均在质量标准控制范围内,符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和2015年版《中国药典》 对重组干扰素 α2b质量标准的要求.紫外光谱检测吸收峰约在225 nm处,液质联用分析肽指纹图谱覆盖率达80％,N-端氨基酸序列结果显示其N端前15个氨基酸与天然蛋白质一致.结论 IFN-CSP符合基因工程药物质量标准的要求,为其进一步应用开发提供了依据.

甘精胰岛素是一种通过基因工程重组技术,利用大肠杆菌或酵母表达得到的一种重组蛋白类药物,是具有长效作用的人胰岛素类似物.该药物在皮下注射后立即聚合,溶解度降低,形成微沉淀物,使吸收、分解和作用时间延长,相当于基础胰岛素的无峰值分泌,发挥长效平稳降血糖的作用[1].宿主细胞残留DNA因有潜在的致癌或传染风险,是基因工程重组产品需要严格控制的杂质.《中国药典》2015年版收载了2种外源性DNA残留检测方法:DNA探针杂交法和荧光染色法.DNA探针杂交法操作周期较长,干扰因素多,重复性较差,宿主菌DNA的种属和质量直接影响检测结果的准确性[2].荧光染色法是利用双链DNA荧光染料与双链DNA特异结合形成复合物,在波长480 nm激发下产生超强荧光信号,用荧光酶标仪在波长520nm处进行检测,在一定的DNA浓度范围内以及荧光染料过量的情况下,荧光信号与DNA浓度成正比[3-4].荧光染色法操作简单快速,不需要宿主DNA作为模板,能够检测出重组制品中全部DNA污染,因而可广泛用于重组蛋白药物残余DNA的检测.

目的 通过经胃左动脉途径灌注,选择胰腺体尾部作为灌注主体,应用各种去细胞化灌注技术,以制备新型天然胰腺去细胞化生物支架,并全面评价其理化特性,以期为胰腺组织再生工程的研究提供良好的应用载体.方法 选择健康成年雄性SD大鼠,离体获取胰体尾部作为灌注主体,采用胃左动脉作为灌注入路,通过物理冻融、酶解法及曲亚通(TritonX-100)为主辅以十二烷基硫酸钠(SDS)的洗脱剂组合进行顺行灌注,获取胰腺去细胞支架.并通过大体形态观察、美兰染色、组织病理学观察、基因组DNA定量分析、电镜观察、胶原蛋白成分鉴定、免疫原性分析等对去细胞化后的胰腺支架进行全面的评价.结果 本研究方法可成功制备肉眼透明的胰腺去细胞化支架,组织学检测和电镜观察均表明去细胞支架内无细胞残留,内部脉管网络和空间结构保存完整;免疫荧光分析表明去细胞化后支架的细胞外基质成分保留得较为完整,且支架DNA残留量为(42.3±10.6)ng/mg,不足正常胰腺的5%;皮下移植实验证实获得的去细胞化支架具有良好的组织相容性.结论 以胰腺体尾部作为灌注主体,经胃左动脉途径灌注的策略能够成功制备一种新型的去细胞化胰腺支架,并且支架的基质成分和理化特性较完整地保留,能够为胰腺组织工程研究提供一种良好的载体选择.