患者，女，40岁，2020年1月诊断为"骨髓增生异常综合征EB-2（WPSS评分3分）"，分别于2020年1月、2020年3月和2020年5月应用地西他滨去甲基化治疗。移植前骨髓原始粒细胞占0.020，微小残留病（MRD）0.77%，WT1基因定量18.658%，NPM1-A基因突变定量1.244%。预处理方案：阿糖胞苷4 g·m -2·d -1，移植前10 d（-10 d）、-9 d，地西他滨20 mg·m -2·d -1，-10 d~-6 d，白消安3.2 mg·kg -1·d -1，-8 d~-6 d，环磷酰胺1.8 g·m -2·d -1，-5 d、-4 d，兔抗人胸腺细胞球蛋白2.5 mg·kg -1·d -1，-5 d~-2 d，司莫司汀250 mg/m 2，-3 d，移植物抗宿主病（GVHD）预防方案：西罗莫司、霉酚酸酯联合短程甲氨蝶呤。患者于2020年8月18日行单倍型造血干细胞移植（女供母，HLA 6/12，AB+供A+），回输供者外周血干细胞单个核细胞（MNC）9.63×10 8/kg，CD34 +细胞3.84×10 6/kg。移植后11 d（+11 d）粒细胞及血小板植活。+3 d患者发生呕血，给予禁食水、抑酸治疗。患者高热，血培养、病毒、细菌、真菌筛查均为阴性，给予广谱抗生素抗感染治疗后体温未降。+8 d，患者出现皮疹。+9 d，患者发生上腹部烧灼感伴腹泻，考虑急性GVHD，加用甲泼尼龙2 mg·kg -1·d -1，体温降至正常。+13 d，患者血脂明显升高（甘油三酯38.18 mmol/L，总胆固醇8.65 mmol/L）。患者间断恶心、呕吐伴上腹不适，+14 d，患者出现乳糜血（甘油三酯41.70 mmol/L，总胆固醇7.49 mmol/L），停西罗莫司（此时西罗莫司浓度17.7 μg/L），改为环孢素A治疗GVHD，甘油三酯降至3.80 mmol/L，总胆固醇降至6.15 mmol/L。+25 d，患者出现嗜睡，恶心、呕吐好转，血巨细胞病毒、EB病毒DNA阴性，环孢素A浓度165.5 μg/L。+26 d，患者昏睡，定向力、计算力障碍、四肢肌力下降，腰穿脑脊液压力100 mmH 2O，氯114.3 mmol/L，葡萄糖8.30 mmol/L，蛋白0.55 g/L。脑脊液细菌培养、真菌培养及抗酸杆菌均阴性，脑脊液神经免疫病检测：血清和脑脊液中AQP4、MOG、MBG抗体均为阴性。脑脊液和外周血病毒PCR筛查均阴性，脑脊液病原体二代测序（NGS）阴性。TMA筛查阴性。头颅平扫+增强磁共振成像（MRI）：双侧颞叶深部（海马区）及室管膜下区、左侧颞叶皮层多发异常信号并下丘对侧斑片明显强化灶。右侧小囊幕增厚并明显强化。结合患者近1个月进食差，伴有恶心、呕吐、腹泻，考虑不除外Wernicke脑病，给予维生素B 1 200 mg每8 h 1次治疗，+27 d患者神志转清，肢体肌力明显好转。患者维生素B 1<1.0 μg/L，明确诊断为Wernicke脑病，继续补充维生素B 1治疗。复查头颅MRI：双侧颞叶（及海马区）及室管膜下区多发异常信号并双侧下丘、右侧小脑幕明显强化灶，较前部分病变信号明显减低，范围减小。+30 d，复查骨髓完全缓解（CR），MRD阴性，NPM1基因突变阴性，短串联重复序列-聚合酶链反应（STR-PCR）完全供者型。+36 d，间断谵妄，给予奥氮平对症治疗后好转，+50 d，患者谵妄好转，停用奥氮平。随访至移植后8个月，患者无明显神经、精神症状及体征，环孢素A血浓度50 μg/L，原发病处于完全缓解状态，MRD阴性，STR-PCR完全供者型。头颅MRI：双侧颞叶（及海马区）及室管膜下区多发异常信号并双侧下丘脑、右侧小脑幕病变强化灶明显减低，范围明显缩小。

目的:探讨脐血间充质干细胞(MSC)联合艾曲波帕治疗异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后移植物功能不良(PGF)患者的疗效及安全性。方法:选择2018年3月至2019年6月，在航天中心医院血液科接受allo-HSCT后，发生PGF的6例患者为研究对象。其中，男性患者为5例，女性为1例；患者中位年龄为33岁(范围：16~45岁)。根据血常规、骨髓细胞形态学、免疫表型及DNA指纹图谱等检查结果，患者被确诊为PGF。采用脐血MSC(1×10 6/kg)联合艾曲波帕(25~75 mg/d)对患者进行治疗。本研究对患者的随访截至2020年3月1日。回顾性分析患者的临床资料、相关实验室检查结果、脐血MSC联合艾曲波帕治疗PGF患者的临床疗效、不良反应及预后。本研究获得航天中心医院医学伦理委员会批准(批准号：20160420-XYZZ-02)，并与全部患者签署临床研究知情同意书。 结果:①本组6例患者的原发疾病中，急性髓细胞白血病(AML)为2例，肝脾T细胞淋巴瘤(HSTCL)为1例，T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-LBC/ALL)为2例，慢性粒单核细胞白血病(CMML)为1例。所有6例患者移植前均处于未缓解状态。allo-HSCT后，均获造血功能重建，粒细胞植入的中位时间为移植后13 d(范围：12~14 d)，有4例患者治疗前血小板未植入，剩余2例患者血小板植入时间分别为移植后13 d及90 d，所有患者在移植后28 d经骨髓DNA指纹图谱证实为完全供者嵌合。6例患者中有5例发生急性移植物抗宿主病(aGVHD)，均为Ⅲ~Ⅳ度aGVHD，经系统治疗后均获得良好控制。②患者的PGF中位诊断时间为移植后57 d(范围：28~370 d)；其临床特征包括血常规检查结果示，2系或者3系血细胞计数持续减少，骨髓细胞形态学检查结果示骨髓增生减低或者明显减低，巨核细胞少见或者缺如，微小残留病(MRD)检查未见原发疾病复发证据。③患者输注脐血MSC的中位次数为3.5次(范围：2~4次)。治疗后，1例患者无效，5例有效，达治疗有效的中位时间为19 d(范围：12~56 d)，并且最终获得造血功能恢复。④患者输注脐血MSC过程中均无不良反应，亦未发生aGVHD及慢性GVHD(cGVHD)症状加重。2例出现间接胆红素水平升高，予以艾曲波帕减量后改善。⑤本组患者的中位随访时间为10.5个月(范围：6~19个月)，截至随访结束，6例患者中5例存活，并处于无病生存状态，存活患者中位总体生存(OS)期为11个月(范围：8~19个月)；1例死亡，其死亡原因为严重肺部感染。结论:脐血MSC联合艾曲波帕治疗allo-HSCT后PGF患者，疗效及安全性均良好。

目的:探讨异基因造血干细胞移植后复发急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）CD19 CAR-T细胞治疗缓解后的维持治疗，观察单独输注供者造血干细胞和供者T淋巴细胞对CD19 CAR-T细胞扩增的影响。方法:1例难治B-ALL患者，CD19 CAR-T（鼠源，克隆号：FMC63）细胞治疗后桥接同胞全相合异基因造血干细胞移植，后再次复发。接受CD19 CAR-T（可变区人源化的FMC63）细胞治疗再次缓解，缓解后先后接受单独输注供者造血干细胞、供者T淋巴细胞的维持治疗，期间监测患者细胞因子水平、CD19 CAR-T细胞比例、CD19 CAR的DNA表达变化，观察骨髓白血病细胞比例及供者嵌合情况。另外，通过制备小鼠CD19 CAR-T（FMC63）细胞，并将CAR-T细胞注射至同窝小鼠体内，14 d后，再次注射同窝小鼠的B淋巴细胞，在此过程中观察CAR-T细胞、B淋巴细胞比例以及CD19 CAR的DNA表达，以此来模拟临床治疗过程。结果:①患者输注人源化CD19 CAR-T细胞后第14天，疗效评估达完全缓解（CR），供者嵌合率为99.76%，细胞因子释放综合征1级。②人源化CD19 CAR-T细胞治疗缓解后，单独输注供者造血干细胞维持治疗，输注后第24天出现移植物抗宿主病（GVHD），患者GVHD期间伴有外周血CD19 CAR-T细胞比例及CD19 CAR DNA水平的升高，并随GVHD缓解下降。过程中患者维持CR且供者嵌合率为99.69%。③随后单独输注供者T淋巴细胞维持治疗，回输后第12天患者出现GVHD，而患者外周血CD19 CAR-T细胞比例及CD19 CAR的DNA水平并未出现再次升高。过程中患者维持CR且供者嵌合率为99.87%。④C57小鼠体内试验证实，CAR-T细胞输注后小鼠体内CAR-T细胞扩增及DNA表达上调，同时CD19 + B淋巴细胞耗竭。之后输注CD19 + B淋巴细胞，CD19 CAR-T细胞扩增和CD19 CAR的DNA表达再度上调。 结论:供者造血干细胞、供者T淋巴细胞的单独输注，可作为异基因造血干细胞移植后复发B-ALL接受CD19 CAR-T治疗缓解后的维持治疗手段，且输注供者造血干细胞诱发GVHD同时出现CD19 CAR-T细胞和CD19 CAR的DNA表达上调，有可能进一步清除残留灶。

目的 建立150 L生物反应器大规模培养狂犬病病毒(rabies virus,RABV)的工艺,为后期开发更大规模高密度微载体反应器工艺奠定基础.方法 应用30 L(型号:C30-2)和150 L(型号:VESSEL FERMENTER 300L)生物反应器,以灌流方式培养Vero细胞和CTN-1V株RABV,Cytodex-1微载体浓度20g/L,培养温度36～38 ℃,DO 20％～60％,pH 7.0～7.4,连续13 d收获病毒液,培养过程中取样检测细胞密度、病毒滴度,并对病毒收获液进行无菌和支原体检查及抗原、宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、DNA残留量检测.结果 30和150 L生物反应器的细胞培养密度均可达1.2×107个/mL以上,在培养过程中各时间点的细胞密度差异均无统计学意义(t=0.225～2.173,P=0.096～0.833).2种规模生物反应器病毒收获液均在感染后6 d达最高病毒滴度(8.5 lgLD50/mL),且差异无统计学意义(t=1.000,P=0.374).2种规模生物反应器病毒收获液的抗原、HCP、BSA和DNA残留量基本一致.结论 可用150 L生物反应器大规模培养RABV,病毒收获液符合《中国药典》三部(2020版)相关标准.

目的 建立严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量荧光定量PCR检测方法,并进行验证,以期更好地控制产品安全性.方法 通过磁珠法对SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)原液进行DNA提取,采用探针型PCR对宿主细胞DNA残留量进行定量分析.对建立的方法进行线性范围、重复性、中间精密度、定量限、专属性、耐用性、准确度验证,并使用该方法对5批SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)进行宿主细胞DNA残留量检测.结果 DNA标准曲线在300～0.003 pg/μL范围内线性良好(R2均≥ 0.99);重复性和中间精密度验证相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均＜20％;定量限为0.001 pg/μL;样品稀释液与纯化液稀释液对检测无干扰;样品于53、55、57 ℃条件下孵育60 min及55 ℃条件下孵育56、60、64min的检测结果无明显差异;准确度验证回收率在79％～83％,RSD＜5％.用该方法检测SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)原液中DNA残留量适应性良好.结论 成功建立了 SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量荧光定量PCR检测方法,该方法线性范围、重复性、中间精密度、定量限、专属性、耐用性和准确度均符合可接受标准,适用于SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量的检测及质量控制.

目的 建立检测抗CD52单克隆抗体原液中残余DNA的方法,并对该方法进行验证.方法 利用CHO Host Cell DNA Extraction&Amplification Kit,采用qPCR法检测抗CD52单克隆抗体中宿主细胞残留DNA含量,并进行方法的专属性、线性、准确度、精密度和耐用性验证.结果 该方法可以准确定量检测CHO细胞残留DNA含量.专属性验证试验中对照制剂无特异扩增曲线,而CHO细胞上清有明显的扩增曲线;5次试验中标准曲线相关系数R2均≥0.98,表明该方法线性良好;准确度验证试验中所有试验的加标回收率均在70％～130％范围内;精密度验证试验中所有试验检测结果的相对标准偏差(RSD)均不大于30％;耐用性验证试验中,Proteinase K不同消化温度下检测结果的CV为0.85％,不同稀释倍数的供试品加标回收率在70％～ 130％范围内,不同稀释倍数外源DNA检测结果CV为4.71％.结论 该方法专属性、准确度、精密度、线性和耐用性均符合要求,可采用该试剂盒qPCR法检测外源DNA残留量.

目的 建立新型肝靶向干扰素(interferon-circumsporozoite protein,IFN-CSP)的质量标准.方法 采用细胞病变抑制法进行生物学活性测定;RP-HPLC法及非还原SDS-PAGE法进行纯度分析;BCA法、ELISA法、抗生素微生物学检定法、凝胶法分别测定蛋白质含量、宿主菌蛋白质残留量、氨苄青霉素残留量和细菌内毒素含量;紫外光谱法确定吸收峰位置;液质联用技术进行肽指纹图谱分析;Edman降解法检测N-端氨基酸序列.结果 IFN-CSP的生物学活性、纯度、蛋白质含量、宿主菌蛋白质残留量、氨苄青霉素残留量及细菌内毒素的检验结果均在质量标准控制范围内,符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和2015年版《中国药典》 对重组干扰素 α2b质量标准的要求.紫外光谱检测吸收峰约在225 nm处,液质联用分析肽指纹图谱覆盖率达80％,N-端氨基酸序列结果显示其N端前15个氨基酸与天然蛋白质一致.结论 IFN-CSP符合基因工程药物质量标准的要求,为其进一步应用开发提供了依据.

甘精胰岛素是一种通过基因工程重组技术,利用大肠杆菌或酵母表达得到的一种重组蛋白类药物,是具有长效作用的人胰岛素类似物.该药物在皮下注射后立即聚合,溶解度降低,形成微沉淀物,使吸收、分解和作用时间延长,相当于基础胰岛素的无峰值分泌,发挥长效平稳降血糖的作用[1].宿主细胞残留DNA因有潜在的致癌或传染风险,是基因工程重组产品需要严格控制的杂质.《中国药典》2015年版收载了2种外源性DNA残留检测方法:DNA探针杂交法和荧光染色法.DNA探针杂交法操作周期较长,干扰因素多,重复性较差,宿主菌DNA的种属和质量直接影响检测结果的准确性[2].荧光染色法是利用双链DNA荧光染料与双链DNA特异结合形成复合物,在波长480 nm激发下产生超强荧光信号,用荧光酶标仪在波长520nm处进行检测,在一定的DNA浓度范围内以及荧光染料过量的情况下,荧光信号与DNA浓度成正比[3-4].荧光染色法操作简单快速,不需要宿主DNA作为模板,能够检测出重组制品中全部DNA污染,因而可广泛用于重组蛋白药物残余DNA的检测.

目的 建立特异的重组人凝血因子Ⅷ产品中CHO细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证及初步应用.方法 采用磁珠分离法提取样品中残留的CHO细胞DNA,再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行Q-PCR检测,根据标准曲线进行DNA残留量分析.对建立的方法进行专属性、准确性、重复性及中间精密度验证,并对重组人凝血因子Ⅷ原液的CHO细胞DNA残留量进行检测.结果 该方法DNA浓度在0.003 ～ 300 pg/μL范围内,线性关系良好,R2为0.999,灵敏度可达0.003 pg/μL;对大肠埃希菌DNA无特异性扩增曲线,专属性良好;检测高、中、低浓度DNA加标量样品的回收率分别为82.68％、71.75％和72.67％,准确性良好;重复性检测的RSD为7.02％,中间精密度检测的RSD为9.31％,重复性及精密度良好.用该方法检测的3批重组人凝血因子Ⅷ原液的DNA残留量均远低于100 pg/剂量.结论 成功建立了特异的CHO细胞DNA残留量的检测方法,该方法专属性好,准确性及精密度高,可作为CHO宿主细胞DNA残留量的常规检测方法.

目的 建立可定量检测门冬氨酸鸟氨酸原料药中毕赤酵母菌DNA残留量的实时荧光定量PCR方法.方法 采用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒 (磁珠法) 提取毕赤酵母菌DNA, 利用毕赤酵母残留DNA检测试剂盒 (PCR-荧光探针法) 进行扩增反应, 绘制标准曲线, 建立毕赤酵母菌DNA残留量的Real-time PCR检测方法, 并验证其准确性和精密性.结果 毕赤酵母菌DNA质量浓度在0.03～300 pg·μL-(16) 内线性良好 (r>0.99), 定量限为0.03 pg·μL-(16);应用该法对3批门冬氨酸鸟氨酸原料药进行测定, 毕赤酵母菌DNA残留量均远低于每剂10 ng.结论 该方法可用于门冬氨酸鸟氨酸原料药中毕赤酵母菌DNA残留量的定量测定.