目的:观察采用液氮保存GGTA1/β4GalNT2双基因敲除近交系五指山小型猪猪皮异种移植的效果。方法:采用冻存双基因敲除猪断层皮片及市售基因转染猪皮进行异种移植。切取双基因敲除猪皮后采用玻璃化方法储皮，使用时复温。受体为恒河猴，分为实验组和对照组，每组4只。于每只猴背部切除4块4 cm×4 cm的皮肤，形成全层皮肤切除模型，分别移植冻存双基因敲除猪皮和基因转染猪皮。术后不同时间点观察皮片成活情况，通过颜色、质地等评估皮片活力，留取标本进行病理检查；于术前及术后4、7、10、14、21 d取血清，检测IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-12含量。结果:实验组猪皮存留于创面时间[10～21(14.5±3.4)d]长于对照组[7～14(10.6±2.7)d]，差异有统计学意义(t＝3.272，P＝0.004)。术后第4天两组皮片均活力良好；术后第7天，实验组2个皮片局部有小水疱，对照组6个皮片皮下有大水疱；术后第10天，实验组5个皮片被完全撕脱，6个皮片整体仍温暖、柔软，对照组4个皮片整体仍温暖、柔软；术后第12天，实验组和对照组分别有3个、1个皮片整体仍温暖、柔软；术后第14天，实验组1个皮片仍保持温暖、柔软，对照组皮片则全部失活。病理观察显示，两组术后第4天皮片组织形态均完整；术后第7天，实验组皮片表皮细胞结构完整，对照组皮片表皮层细胞数量减少，两组均可见部分皮片与基底床形成嫁接；术后第10天，实验组表皮层细胞数量减少，表皮与真皮交界面局部分离，对照组表皮层细胞数量较前进一步减少，仍可见部分皮片与基底床嫁接现象；术后第14天，实验组表皮层细胞数量明显减少，仍可见嫁接现象，对照组可见基底床炎细胞浸润。实验组术后第10天血清IL-2和IL-4水平、术前与术后第4天血清IFN-γ水平、术后第14天血清IFN-γ/IL-4高于对照组。结论:采用冻存GGTA1/β4GalNT2双基因敲除近交系五指山小型猪猪皮移植后皮片存留于创面情况良好，可获得较长的创面存留时间。

研究对前期建立的青鱼(Mylopharyngodon piceus)家系高密度遗传连锁图谱及体长QTL的定位结果进行深入分析,在10号连锁群上识别到与体长相关的QTL区域,存在2个与体长强烈相关的紧密连锁SNP位点.研究利用特异性标记判定青鱼遗传性别,对SNP位点侧翼序列PCR扩增子进行sanger测序.得到准确的SNP位点基因型信息后,研究对紧密连锁SNP位点不同基因型与邗江青鱼群体生长性状进行了细致的关联分析.结果表明,在563尾邗江青鱼群体中,雌鱼290尾,雄鱼273尾,雌雄比约为1.06:1.遗传分析显示,SNP7957G＞C和SNP9802T＞A有效等位基因数(Ne)分别为1.754和1.399,观测杂合度(Ho)分别为0.384和0.266,期望杂合度(He)分别为0.430和0.285,多态信息含量分别(PIC)为0.508和0.378.相比雄鱼,雌鱼生长速度更快,但是变异系数更高,说明雌鱼生长性状离散程度更大.SNP7957G＞C和SNP9802T＞A不同基因型在群体体长性状中存在显著差异.SNP7957G＞C位点的GG基因型在雄鱼体长性状中具有显著优势(P＜0.05),SNP7957G＞C和SNP9802T＞A单标记其他基因型与生长性状之间存在差异,但未达到统计学差异.在SNP位点不同基因型构建的二倍型中,雌雄个体表现出一定的生长差异,D8(GGTA)在生长方面具有显著优势(P＜0.05),具有一定育种价值.研究结果可为选育快速生长青鱼新品种提供分子标记,为未来青鱼遗传改良和分子标记辅助育种策略提供科学依据.

目的 探讨五指山小型猪近交系不同世代及其 GGTA1/b4GalNT2 基因敲除猪繁育后个体外周血红细胞 aGal表达水平,为开发应用提供科学依据.方法 利用异硫氰酸荧光素(FITC)分离技术,对五指山小型猪近交系不同世代及其 GGTA1/b4GalNT2 基因敲除猪繁育后代外周红细胞 aGal表达水平进行了测定研究.结果 组 1 近交系F27-2826 头小型猪红细胞 aGal免疫荧光反应百分数平均值为 56.17%(16.2%～86.2%);组 2 F248 头小型猪平均值为 65.39%(35.5%～99.2%);组 3 F19-2121 头小型猪平均值为 82.15%(38.8%～89.4%).组 1 与组 3 之间平均值差异有统计学意义(P<0.05);进一步分析发现组 1 与组 2、组 2 与组 3 相比,个体红细胞 aGal免疫荧光反应百分数代间分别下降 3.07%和 4.19%.组 4 中有 8 头 GGTA1/b4GalNT2 基因敲除猪繁殖后代和 1 头已知为 GGTA1/b4GalNT2+hCD46+hCD55+hTBM 五基因修饰纯合子猪的红细胞 aGal免疫荧光反应测定值均为 0.1%,与对照组结果一致.参与测定的 8 头 GGTA1/b4GalNT2 基因敲除猪繁育后代为纯合子个体.同胞兄妹 F27 两头 aGal低表达量为 16.2%和 19.5%,均低于 GGTA1/b4GalNT2 基因敲除杂合子后代猪平均值 31.03%.结论 随近交系推进其个体红细胞 aGal表达量逐步降低;8 头 GGTA1/b4GalNT2 基因敲除猪繁育后代为纯合子个体;近交系 F27 两头为 aGal低表达个体.

目的:考察2种Gal抗原缺失小鼠对外来抗原刺激的免疫应答特性,分析其用于Gal抗原阳性材料免疫毒性评价的敏感性.方法:采用外来Gal抗原(兔血红细胞,RRBC)免疫刺激2种Gal抗原缺失小鼠(GGTA1单基因敲除,KO与GGTA1/iGb3S双基因敲除,DKO),比较分析经免疫刺激后2种小鼠的免疫应答特性和敏感性,包括:特异性抗-Gal抗体水平,与免疫排斥反应及炎症反应相关的细胞因子表达水平和脾脏淋巴细胞亚型分型比例.结果:GGTA1/iGb3S DKO小鼠经腹腔内RRBC免疫刺激2次后,血清抗-Gal IgG和抗-Gal IgM水平与未接受免疫刺激的小鼠相比,分别升高约41倍和184倍;同时,脾脏T细胞亚型标志物(CD3+CD8+)水平轻度增高.GGTA1 KO小鼠经RRBC免疫刺激2次后,血清抗-Gal IgG和抗-Gal IgM水平与未接受免疫刺激小鼠相比,分别升高约92倍和407倍;同时,脾脏B细胞亚型标志物(CD3-CD19+)水平轻度升高.然而,与GGTA1/iGb3S DKO小鼠相比,可能由于个体间差异较大,除了2次免疫后抗-Gal IgG在800倍稀释,抗-GalIgM在3 200倍稀释时略高之外,其他并不存在显著性差异.2种Gal抗原缺失小鼠在RRBC免疫刺激后的NK细胞亚型标志物水平及细胞因子(IFN-gama,IL-4与IL-12P70)表达水平未见明显变化.结论:2种Gal抗原缺失小鼠均对外来抗原刺激具有较强的敏感性,表现为特异性抗-Gal抗体的显著升高,然而,GGTA1/iGb3S DKO小鼠与GGTA1 KO小鼠相比,未表现出更高的敏感性.因此,作为异种免疫原的免疫学评价模型,GGTA1 KO小鼠和GGTA1/iGb3S DKO小鼠都是敏感的实验动物模型.本研究采用的RRBC预免疫方法既能够提升小鼠的抗-Gal抗体水平,又不引起显著的免疫毒性反应,为后期用于动物源性生物材料的免疫学评价实验动物模型的应用奠定了基础.

目的 供体的短缺是器官移植所面临的主要问题,制备人源化器官是解决此问题的有效途径之一.缺乏延胡索酸乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase,FAH)会引起遗传性酪氨酸血症Ⅰ型(hereditary tyrosinemia typeⅠ,HTⅠ),致使患者肝细胞凋亡,呈现出肝损伤.对猪(Sus scrofa)进行基因编辑,建立FAH基因敲除巴马小型猪,结合人干细胞将有利于人源化干细胞肝的制备.本研究在 α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除巴马小型猪的基础上,通过CRISPR/Cas9技术制备FAH基因敲除(FAH+/-、FAH-/-)小型猪,并分析其健康与繁育状况.方法 针对猪FAH基因设计单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)构建pX330表达载体转染巴马小型猪耳成纤维细胞(ear fibroblasts of Bama minipigs,BMEF)并进行敲除效率验证,鉴定后选择阳性细胞作为核供体,通过体细胞核移植技术制备FAH基因敲除巴马小型猪.提取仔猪的基因组DNA,经PCR测序后得到突变类型;采集5月龄FAH+/-巴马小型猪血液,检测其血生化与血常规指标并观察肝组织学染色切片;当FAH+/-巴马小型猪公猪性成熟后,与野生型(wild type,WT)母猪配种,以其产仔数评价繁育能力状况.结果 得到了FAH+/-巴马小型猪,Western blot显示FAH+/-巴马小型猪的肝和肾中FAH的表达量均有所下降;FAH+/-猪与野生型相比,FAH+/-猪血液理化指标无显著差异;组织学切片染色发现FAH+/-猪肝组织形态出现空泡样变化;与FAH+/-公猪配种的野生母猪产仔数正常;FAH+/-猪具有正常的健康状况和繁育能力.结论 本研究制备出了FAH单基因敲除小型猪,健康状况及繁育能力正常,该单基因敲除猪为将来制备出双等位基因敲除猪与人源化肝的研究提供了良好基础.

目的:利用CRISPR/Cas9技术建立五指山小型猪近交系GGTA1/β4GalNT2双基因敲除克隆猪.方法:设计合成靶向猪GGTA1和β4GalNT2基因的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为骨架,分别构建GGTA1和β4GalNT2的Cas9打靶载体,转染至近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)中,通过G418药物筛选和测序鉴定获得双基因敲除的单细胞克隆,然后利用体细胞克隆技术(somatic cell nuclear transfer,SCNT)获得双基因敲除的近交系五指山小型猪,并利用流式细胞技术检测克隆猪外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中αGal和Sd(a)抗原的表达.结果:成功构建GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得双基因敲除的近交系五指山小型猪PFF细胞克隆9个.SCNT成功获得了10只五指山小型猪近交系双基因敲除的克隆猪,其PBMC无αGal和Sd(a)抗原的表达.结论:CRISPR/Cas9技术可以实现对猪GGTA 1/β4GalNT2基因的编辑.本实验首次成功制备了GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的近交系五指山型猪,为异种器官移植研究与应用提供了新的供体材料.

目的:对使用不同种属小鼠进行脾淋巴细胞增殖试验的适宜性和可比性进行研究.方法:分别获取BALB/c小鼠、野生型C57BL/6(简称C57)小鼠、Gal抗原缺失(C57背景,GGTA1基因被敲除)小鼠的脾淋巴细胞,在确定脾淋巴细胞数量与CCK8吸收度的线性范围后,设立阳性对照组(刀豆蛋白A,Con A)、不同稀释度的动物原材料匀浆液和脱细胞生物材料匀浆液等试验组,使用CCK8检测淋巴细胞增殖,流式细胞术测定淋巴细胞亚型百分比,以确定BALB/c小鼠、野生型C57小鼠和Gal抗原缺失小鼠在体外淋巴细胞增殖试验的适宜性和可比性.结果:C57小鼠脾淋巴细胞数量和CCK8的吸收度的线性范围要明显大于BALB/c小鼠,而BALB/c小鼠线性曲线的斜率明显大于C57小鼠.从CCK8检测的淋巴细胞增殖结果看,BALB/c小鼠与C57小鼠相比,2.5 μg· mL-1的Con A对2种小鼠脾淋巴细胞增殖均出现明显刺激作用;牛跟腱(含低水平的Gal抗原)匀浆液对2种小鼠脾淋巴细胞增殖均显示刺激作用,并显示出量效关系;不同稀释度的胶原海绵(牛跟腱来源)匀浆液对2种小鼠脾淋巴细胞增殖均未显示刺激作用,表现了一致的结果,说明没有淋巴细胞促增殖作用.另外,来源于Gal抗原缺失小鼠与野生型C57小鼠的脾脏淋巴细胞对Con A、牛心包(含有高水平的Gal抗原)匀浆液均表现出强的增殖反应和相似的反应强度.流式细胞术检测结果显示牛心包匀浆原液组在Gal抗原缺失小鼠仅显示活化B细胞百分比与对照组相比有统计学显著性差异,而在野生型C57小鼠组其活化B细胞、活化T细胞、活化NK细胞、NKT细胞、CD4 T细胞百分比与对照组相比均有统计学显著性差异.结论:CCK8检测的各试验组淋巴细胞增殖率结果在C57小鼠与BALB/c小鼠、Gal抗原缺失小鼠与野生型C57小鼠间具有可比性,表明这些种属的小鼠均可用于体外淋巴细胞增殖试验.

目的 比较在Gal抗原缺失小鼠皮下分别植入GGTA1/B4GalNT2/CMAH基因敲除猪软骨组织与野生型猪软骨组织所引起的免疫反应.方法 将三基因敲除猪软骨组织(KO组)与野生型猪软骨组织(WT组)分别植入Gal抗原缺失小鼠皮下4周,设立假手术组(con)作为阴性对照.4周后抽取小鼠血清检测总IgM抗体和抗Gal抗体.结果 野生型猪软骨(WT)材料植入组小鼠总IgM含量平均在(0.525±0.224) mg/ml,显著高于阴性对照(Con)组小鼠总IgM平均含量(0.121±0.050) mg/ml(P＜0.05),但与三基因敲除猪软骨(KO)组小鼠总IgM平均含量(0.313±0.061) mg/ml无统计学差异.野生型猪软骨组织具有比三基因敲除猪软骨组织组和对照组更高的抗α-Gal IgM水平(P＜0.05),而三基因敲除组与对照组相比无统计学差异(P＞0.05).结论 上述结果表明GGTA1/B4GalNT2/CMAH基因敲除猪软骨组织在体内几乎没有免疫反应,可作为软骨缺损修复材料.

背景:有研究表明一种称为α-Gal的糖抗原是动物源性生物材料或异种器官移植引起超急性免疫排斥反应的主要靶抗原.目的:研制Gal抗原缺失兔模型,预期用于评价植入性医疗器械,其局部植入后对宿主的局部免疫反应及非特异性炎症反应风险.方法:选用SPF级6-8月龄新西兰大白兔作为模式动物蓝本,制备Gal抗原缺失兔模型.采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术,针对调控兔子Gal抗原表达的GGTA1基因第8外显子设计构建2条相辅的sgRNA.经转录后将GGTA1 sgRNA mRNAs与Cas9 mRNA共显微注射到体外培养的兔子受精卵中,继续短暂体外培养后植入代孕母兔体内,经自然妊娠获得仔兔.基因编辑成功与否通过凝胶电泳和基因测序进行验证.Gal抗原的表达参照行业标准给出的方法(YY/T 1561-2017)进行检测.研究经中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所动物伦理委员会批准[批准号:中检动(福)第2017(B)007号].结果与结论:①基因编辑后的胚胎被转移至4只代孕兔体内,自然妊娠后获得15只基因编辑仔兔,仔兔的外观发育及进食行为等未见异常;②凝胶电泳及基因测序结果显示15只仔兔中有14只的靶向基因被成功编辑,但编辑的碱基并不相同;随机检测其主要脏器Gal抗原,表达均降低了99.96％以上;③结果表明,Gal抗原缺失兔子有望用于动物源性医疗器械的免疫原性风险评价和异种骨、角膜等原位植入实验,以便能够更客观科学地评价动物源性医疗器械的安全性和有效性.

目的 探索GGTA1基因敲除猪胰岛细胞移植到Ⅰ型糖尿病猴的效果.方法 本研究采用GGTA1基因敲除新生猪胰岛细胞开展了3例猪-猴异种胰岛移植实验.结果 3只猕猴成功进行胰岛细胞移植治疗,术后生命体征平稳,未发生静脉栓塞症状.移植后血糖和外源胰岛素用量均显著降低,能检测到特异性猪C肽.移植后3只猕猴均发生了酮症酸中毒症状,1只猕猴发生伤口感染,经对症处理后均健康存活达16周.结论 GGTA1基因敲除新生猪胰岛细胞经肝门静脉移植治疗1型糖尿病的方法是有效的.