目的:建立H5N1假病毒的体内感染模型，并对抗体FHA3的体内中和活性进行鉴定。方法:依据A/Anhui/1/2005/H5N1毒株血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的序列信息，构建重组表达质粒pcDNA3.1-HA5和pcDNA3.1-NA1，并与质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染293T细胞制备H5N1假病毒上清，电镜观察上清中假病毒颗粒形态。假病毒上清感染MDCK细胞后，测定病毒滴度；经腹腔注射入BALB/c小鼠体内，在感染后2、5、8、12 d进行生物发光成像，检测假病毒体内感染情况。利用建立的小鼠感染模型，评价抗体FHA3的体内功能活性。结果:重组表达质粒pcDNA3.1-HA5和pcDNA3.1-NA1构建正确，与pNL4-3.Luc.R-E-质粒共转染293T细胞可制备出高滴度的假病毒上清，电镜下可见圆形的病毒颗粒。H5N1假病毒感染后，小鼠体内发出较强的荧光，而攻毒前给予抗体FHA3处理可减弱其荧光信号。结论:成功构建出H5N1假病毒体内感染模型，并证实抗体FHA3对假病毒的感染具有体内保护作用。

目的:了解2016—2022年深圳市普通手足口病(HFMD)病例中肠道病毒71型(EV71)流行情况及VP1区基因特征。方法:收集2016—2022年深圳市哨点医院普通HFMD样本，采用荧光RT-PCR方法筛选EV71阳性样本，并将筛选出的38份样本进行VP1序列全长扩增和测序，进而运用DNAStar和MEGA 6等生物信息学软件对其进行比对和系统进化分析。结果:2016—2022年深圳市哨点医院中HFMD患者EV71感染例数从2016年的136例降低到2022年的0例，其中2018—2019年EV71感染例数相比2016—2017年下降了96.3%(257/267)，2020—2022年EV71感染例数均降为0，而在此期间，HFMD患者中EV71疫苗接种率从6.4%上升到39.6%；进化分析显示，2016—2022年深圳市的38株EV71之间核苷酸同源性为91.8%～99.9%，氨基酸同源性为98.3%～100.0%，均属于C4a亚型；其中有26株属于本地流行株，11株为外省输入株，与海南、云南、四川、天津、河南、吉林等地流行株亲缘关系较近，还有1株2017年毒株属于境外输入，与美国流行株OP207969-USA-2017亲缘关系最近；进一步将深圳市2016—2022年EV71流行株与EV71重症株进行比较，发现4个与重症相关的氨基酸突变位点，分别为R22H、K43R、I249V、T289A。结论:2016—2022年深圳市EV71流行株均属于C4a亚型，随着疫苗接种率提高，其感染病例数呈下降趋势。同时深圳市EV71毒株分布呈现本地株大幅度减少，外地输入株为主的特点。深圳市2016—2022年EV71样本毒株中共有4个与重症相关的氨基酸突变位点，其中22R、289T位于VP1的N端和C端，与EV71吸附靶向细胞有关，43R位点与Annexin2蛋白结合有关，会增强细胞结合力。

目的:在大鼠结核性创面模型中探讨弗氏完全佐剂对自噬蛋白表达的影响。方法:采用实验研究方法。第1批取12只6周龄雄性SD大鼠，臀部皮下注射弗氏完全佐剂致敏，3周后于大鼠背部脊柱两侧皮下注射牛分枝杆菌减毒株(BCG)感染，成功建立结核性创面大鼠模型后，按照随机数字表法(分组方法下同)分为感染8 d组、感染15 d组、感染32 d组、感染43 d组，每组3只，继续正常喂养至感染后相应天数。第2批取23只6周龄雄性SD大鼠，分成空白对照组3只(正常喂养未行任何处理)、单纯BCG组5只、BCG＋雷帕霉素组6只、BCG＋3-甲基腺嘌呤组6只、BCG＋饥饿组3只。后4组大鼠同前致敏，1周后同前感染。单纯BCG组大鼠感染后正常喂养未行任何处理；BCG＋雷帕霉素组大鼠感染后腹腔注射雷帕霉素隔日1次，正常喂养；BCG＋3-甲基腺嘌呤组大鼠感染后腹腔注射3-甲基腺嘌呤隔日1次，正常喂养；BCG＋饥饿组大鼠感染后饥饿48 h后正常喂养。将第1批4组所有大鼠分别于感染后相应天数处死，取臀部注射弗氏完全佐剂处的组织；将第2批单纯BCG组、BCG＋雷帕霉素组、BCG＋3-甲基腺嘌呤组、BCG＋饥饿组大鼠于感染后7 d同前取材，空白对照组所有大鼠于相同时间点取相同部位组织。行苏木精-伊红染色，观察取材部位组织细胞结构形态；采用免疫组织化学法观察取材部位组织中Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)蛋白表达情况。对数据行Kruskal-Wallis检验及Bonferroni校正。结果:感染8 d组大鼠注射弗氏完全佐剂部位组织可见炎症细胞浸润，感染15 d组可见肉芽肿形成，感染32 d组、感染43 d组可见部分组织细胞坏死，感染43 d组细胞坏死较感染32 d组加重。感染后7 d，单纯BCG组、BCG＋雷帕霉素组、BCG＋3-甲基腺嘌呤组、BCG＋饥饿组大鼠注射弗氏完全佐剂部位组织均可见炎症细胞浸润，空白对照组细胞排列规整且未见炎症细胞浸润。感染8 d组、感染15 d组、感染32 d组、感染43 d组大鼠注射弗氏完全佐剂部位组织Beclin-1、LC3B蛋白表达，组间总体比较差异无统计学意义( H＝1.923、5.821， P>0.05)。感染后7 d，空白对照组、单纯BCG组、BCG＋雷帕霉素组、BCG＋3-甲基腺嘌呤组、BCG＋饥饿组大鼠注射弗氏完全佐剂部位组织Beclin-1和LC3B蛋白表达分别为0.325%(0.250%，0.360%)、3.225%(1.340%，3.987%)、4.823%(2.630%，6.559%)、4.216%(1.790%，5.969%)、1.765%(0.865%，2.649%)和0.301%(0.264%，0.516%)、2.865%(1.455%，5.768%)、1.033%(0.398%，1.873%)、1.168%(0.429%，1.907%)、0.655%(0.283%，1.652%)，其中BCG＋雷帕霉素组大鼠注射弗氏完全佐剂部位组织Beclin-1蛋白表达明显高于空白对照组( Z＝4.796， P<0.05)，单纯BCG组大鼠注射弗氏完全佐剂部位组织LC3B蛋白表达明显高于空白对照组( Z＝4.953， P<0.05)。 结论:结核性创面大鼠模型中弗氏完全佐剂可以增强局部组织自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B蛋白的表达水平。

[目的]了解浙江省义乌市2017-2022年流感样病例(ILI)活动水平和流行动态,为当地调整流感防控策略提供参考.[方法]采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法对ILI鼻咽拭子标本进行流感病毒分型检测,对结果进行统计和分析.[结果]2017-2022年义乌市共报告ILI106 661例,年报告病例数分别为31 273、33 522、20 090、9 965、3 202和8 609例,以≤14岁人群为主,占89.16%.共采集检测ILI标本6 893份,流感病毒核酸阳性945份,总阳性率为13.71%,以H3N2、B-Victoria为主,占比分别为40.63%(384/945)、35.03%(331/945).阳性率以2019年最高,为25.19%(265/1 052);2020、2021年阳性率显著下降,分别为5.74%(66/1 149)、5.77%(75/1 300);2022年有所回升,为13.85%(180/1 300).H3N2阳性占比以2017年最高,占69.14%(168/243);H1N1阳性占比以2018年最高,50.86%(59/116);B-Victoria阳性占比以2021年最高,占100.00%(75/75);B-Yamagata阳性占比以2018年最高,占5.17%(6/116).[结论]义乌市ILI季节性流行特征较为明显,呈现冬春、夏两峰型,H3N2、B-Victoria、H1N1等优势毒株呈交替或混合流行.新型冠状病毒感染大流行期间季节性ILI显著减少,采取的一系列防控措施对ILI的防控有积极的作用.

目的 通过研究2018-2022年辽宁省沈阳市监测周期中流感病毒的病原学监测情况,了解该市流感病毒的流行特征,同时,对乙型流感病毒的血凝素全长基因进行扩增,分析沈阳市流感病毒流行的分子特征及谱系进化特点.方法 采集2018年10月1日至2022年3月31日沈阳市哨点医院门诊ILI咽拭子标本,应用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法确认流感病毒核酸阳性后进行病毒分离,选取部分乙型流感毒株,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法对其血凝素全长基因进行扩增测序,使用Snapgene软件对测序结果进行拼接,Clustal W比对多重序列,最后使用MEGA 7.0软件构建进化树分析氨基酸突变位点.结果 2018-2022监测周期中沈阳市流感病毒检出总阳性率为5.00％,主要以A/H1N1型病毒为主(44.38％),其次是A/H3N2病毒(28.37％)和B/Victoria(27.24％),未检测到B/Yamagata系毒株.在2020-2021和2021-2022两个流行季中B/Victoria系毒株占比分别为83.33％和86.66％,为绝对优势株,且人群分布中5～14岁年龄组易感.沈阳市分离到的B/Victoria系毒株其血凝素基因均在V1A分支上.与疫苗株相比,流行株在HA蛋白的120环、150环、160环及190螺旋等关键抗原决定簇部位有多个氨基酸位点突变.结论 在2018-2022年监测周期中,流感病毒流行的亚型多样性减少,但B/Victoria系遗传多样性增加,而且在多个关键抗原决定簇上发生突变,因此,需对流感的流行特征和乙型流感分子进化情况作以持续的监测,为以流感为主的呼吸道传染病防控提供科学依据.

目的 利用甲型肝炎(甲肝)病毒(HAV)H2减毒株制备甲肝灭活疫苗,分析免疫剂量,为甲肝灭活疫苗的研发与生产提供参考.方法 采用HAV H2减毒株感染人胚肺二倍体细胞(KMB17)增殖病毒,收获含病毒的细胞,经提取、纯化和灭活后,制备成疫苗原液和抗原含量为1 280 EU/mL的试验疫苗;根据《中华人民共和国药典》三部(2020年版)对疫苗的各项指标进行检定.110只小鼠随机分为11组,包括试验疫苗、参比疫苗各5个剂量组(80、160、320、640和1 280 EU/剂)和佐剂对照组,腹腔注射免疫2次,检测血清HAV抗体,分析抗体几何平均滴度(GMT)和抗体阳转率,判断免疫剂量.结果 病毒收获液的抗原含量和病毒滴度分别为5 120 EU/mL和8.33 lgCCID50/mL,杂蛋白去除率为98.05%,抗原回收率为66.25%;试验疫苗各项指标检定结果均符合《中华人民共和国药典》三部(2020年版)的要求.试验疫苗和参比疫苗各剂量组二次免疫后小鼠血清HAV抗体GMT较初次免疫平均增加2倍以上;无论初次免疫还是二次免疫,试验疫苗160 EU/剂及以上剂量组小鼠血清HAV抗体GMT(log2)高于80 EU/剂组(均P<0.05),但160 EU/剂及以上剂量组之间差异无统计学意义(均P＞0.05);二次免疫后,试验疫苗160 EU/剂及以上组HAV抗体阳转率均为100.00%.结论 本研究制备的H2减毒株甲肝灭活疫苗在小鼠体内具有良好的免疫原性,可作为甲肝灭活疫苗的候选疫苗,初步分析其免疫剂量为320 EU/剂(儿童)和640 EU/剂(成人).

目的 探究Omicron毒株引起的新型冠状病毒感染(新冠感染)者康复后3～4个月存在相关持续症状的特征及其影响因素,为制定随访计划、减少感染后相关持续症状提供依据.方法 采用自编的躯体与精神神经症状量表、患者健康问卷(patient health questionnaire,PHQ-9)、压力知觉量表(Chinese perceived stress scale,CPSS)、焦虑量表(generalised anxiety disorder scale,GAD-7)和自编的疾病污名化量表进行调查.采用Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis H检验、x2检验和二元logistic回归分析模型分析.结果 有50.7％的受访者在康复后3～4个月存在相关持续症状,共报告躯体与精神神经症状47种,疲劳乏力是最常见的躯体症状(50.5％),失眠是最常见的精神神经症状(24.3％),抑郁和焦虑均与躯体或精神神经症状伴随出现.女性(β=0.70,OR=2.01,95％CI:1.04～3.86,P=0.037)、隔离期间存在临床症状(β=0.78,OR=2.17,95％CI:1.13～4.20,P=0.021)、中高压力(β=1.68,OR=5.35,95％CI:2.14～13.38,P＜0.001)、严重污名化(β=1.03,OR=2.79,95％CI:1.33～5.83,P=0.006)是新冠感染者出院3～4个月后存在持续症状的危险因素.结论 部分新冠感染者康复后3～4个月时仍存在相关持续症状.重点关注可能出现相关持续症状的高风险人群,并同时在医疗保健和精神心理卫生方面给予支持.

目的 分析2016-2023年度长沙市A(H1N1)pdm09流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因特征,了解HA基因遗传进化趋势和氨基酸突变情况,为新形势下流感疫情的防控、流感疫苗筛选提供科学依据.方法 无特定病原(specific pathogen free,SPF)鸡胚分离法获得2016-2023年长沙市的A(H1N1)pdm09流感病毒毒株,使用Illumina公司的MiSeq对其进行二代测序测定.借助DNAStar中MegAlign软件分析HA基因的同源性,构建进化树使用Molecu-lar Evolutionary Genetics Analysis version 11(MEGA11)软件中的Neighbor Joining(NJ)法进行.结果 2016-2023年长沙市的A(H1N1)pdm09流感病毒HA基因同源性为94.8％-99.9％,HA基因同源性逐年降低.2016-2023年度长沙市A(H1N1)pdm09分离株与WHO疫苗推荐株同源性为96.8％-99.0％,流感分离株与疫苗推荐株匹配性相对较好.长沙市的A(H1N1)pdm09流感病毒HA基因进化树显示其在6B分支中进化出多个不同分支,目前已进化到6B.1A.5a.2a分支.HA 4个抗原决定簇氨基酸位点不断发生变异,目前4个抗原决定簇中的15个抗原位点氨基酸发生突变,分离株在2023年新出现的A186T抗原变异位点近期值得关注.受体结合位点在130环相对保守,220环零星发生氨基酸变异,190环氨基酸变异位点是否日趋稳定还需加强监测.以A/Califomia/07/2009(CY121680)为参考株,近年来长沙市大部分A(HlNl)pdm09分离株增加了 162 NQTY糖基化位点,减少了276 NTTC糖基化位点,目前这2个位点的糖基化变异日趋稳定.结论 长沙市A(H1N1)pdm09病毒HA基因不断进化变异,提示病毒有逃逸免疫反应可能,我们应持续加强流感监测.

目的 根据贵州省手足口病患儿肠道病毒71型(EV71)分离株的VP1结构蛋白序列研制多肽疫苗并研究其对小鼠的免疫保护作用.方法 2013年3月1日至2015年12月31日从贵州省手足口病患儿的咽拭子样本中分离到17株EV71毒株,其VP1氨基酸序列一致(共297个氨基酸),据此设计并合成多肽片段(除最后一段为27个氨基酸外,其余均为20个氨基酸);用感染EV71的手足口病病愈患儿的阳性血清,通过间接ELISA法筛选出免疫原性较好的多肽片段,制成多肽疫苗;用多肽疫苗免疫ICR健康雌鼠,并设未免疫的对照(Con);将雌鼠的子代小鼠随机分为注射和不注射EV71病毒颗粒的2个亚组;注射病毒2d后处死所有小鼠,分别取小鼠的骨骼肌、小肠和脑组织,通过RT-PCR检测病毒感染情况,同时HE染色后在显微镜下观察病理改变.结果 共设计并合成19段含交叉序列的多肽片段,从中筛选出3段免疫原性较好的(P2:VSRALTHALPAPTGQNTQVS;P4:ALQAAEIGASSNASDESMIE;P8:YANWDIDITGYAQMRRKVEL),制成多肽疫苗并免疫雌鼠,取雌鼠的子代小鼠进行后续试验.RT-PCR结果显示,各感染病毒亚组的骨骼肌、小肠和脑组织中均能检测到EV71病毒,而未感染病毒亚组均检测不到;病理结果显示,未接种多肽疫苗母鼠的子代小鼠在感染EV71病毒后,骨骼肌、小肠和脑组织均出现明显的炎性改变;接种多肽疫苗母鼠的子代小鼠骨骼肌、小肠和脑组织的炎性改变明显减轻,3种多肽疫苗对EV71所致炎症的改善作用无明显差异;接种多肽疫苗母鼠的未注射病毒亚组子代小鼠骨骼肌、小肠和脑组织中均未检测到EV71病毒,也未观察到明显的炎性改变.结论 本研究成功制备VP1抗原表位多肽疫苗并在动物实验中证实了其有效性和安全性,可为今后相关疫苗的研制提供方法学借鉴.

目的:检测小檗碱(Berberine)对流感病毒A/PR/8/34(H1N1)感染的脐静脉内皮细胞(HumanUmbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)细胞骨架及通透性的影响.方法:常规鸡胚增殖传代甲型流感病毒A/PR/8/34,-80℃冰箱保存,空斑实验检测病毒滴度;将HUVEC接种于96孔板,MTT法检测小檗碱对HUVEC的细胞毒性;用30 MOI A/PR/8/34病毒株刺激病毒组和小檗碱给药组HUVECs,小檗碱组加入5μg/mL小檗碱溶液,分别于给药的第0、2、6、12、24、36小时检测各组电阻值;激光共聚焦检测观察各组细胞骨架形态.结果:A/PR/8/34的病毒滴度为(2～3)×108 PFU/mL;小檗碱对HUVEC最大无毒浓度为10μg/mL,细胞存活率约为94.05％;小檗碱组(5μg/mL)较病毒组细胞通透性显著降低(P＜0.05),且与正常组相差不大(P＞0.05);小檗碱组与病毒组相比,HUVEC细胞内球状肌动蛋白聚合成丝状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin)分布于细胞膜,应力纤维减少,且细胞边缘恢复平整,呈现出不规则多边形,与正常组细胞表现趋向一致.结论:小檗碱具有改善流感病毒感染后的内皮细胞骨架重构、细胞收缩和细胞形态改变的作用,从而改善流感病毒感染后内皮细胞通透性的升高.