目的:评价结核分枝杆菌PstS1和HspX蛋白的体液和细胞免疫反应性，为结核病免疫学诊断和疫苗候选抗原的筛选提供参考。方法:利用分子克隆表达和Ni 2＋亲和层析技术纯化获得重组目的蛋白PstS1和HspX。收集健康志愿者和结核分枝杆菌感染志愿者血液样本及其背景流行病学资料，以重组PstS1和HspX蛋白作为抗原，进行酶联免疫吸附试验(ELISA)和酶联免疫斑点试验(ELISPOT)分别检测特异性IgG抗体和分泌IFN-γ的抗原特异性T淋巴细胞。对数据进行统计学分析，评价重组PstS1和HspX蛋白的体液和细胞免疫反应性。 结果:重组PstS1和HspX蛋白均能特异性刺激结核分枝杆菌感染者体内较多的效应T细胞分泌IFN-γ，结核分枝杆菌感染组与健康对照组的检测结果差异有统计学意义( P<0.01)；重组PstS1和HspX蛋白作为ELISPOT诊断抗原的特异度和灵敏度分别为92.11%(35/38)和65.96%(31/47)，68.42%(26/38)和91.49%(43/47)。重组PstS1和HspX蛋白也具有一定的体液免疫反应性，但仅HspX蛋白特异性抗体水平在结核分枝杆菌感染组与健康对照组间的差异有统计学意义( P<0.05)。 结论:重组PstS1和HspX蛋白均具有较好的细胞免疫反应性，属于细胞免疫优势抗原。两者均具有较好的细胞免疫诊断性能，同时也是较好的潜在抗结核疫苗候选抗原。

目的:初步评价自主构建的结核多组分重组蛋白疫苗EPRHP014免疫原性和保护效果，为研制结核新疫苗、有效防控结核病提供科学基础。方法:选择结核分枝杆菌全长蛋白抗原3种（EsxH、Rv2628和HspX）和经表位预测和优化的表位优势蛋白抗原2种（nPPE18和nPstS1），共5种组分构建蛋白抗原组合物EPRHP014，包括融合表达纯化的多组分蛋白抗原（EPRHP014f）和分别表达纯化单个蛋白构成多组分混合蛋白抗原（EPRHP014m）。EPRHP014f和EPRHP014m分别辅以铝佐剂制备多组分蛋白疫苗，采用卡介苗（BCG）作对照。皮下注射免疫BALB/c小鼠后，采用ELISA法检测血清特异性抗体效价，采用ELISpot和Luminex技术检测多种细胞因子分泌情况，采用结核分枝杆菌体外生长抑制试验观察其免疫保护作用。结果采用 t检验或秩和检验进行统计分析。 结果:EPRHP014m和EPRHP014f免疫小鼠后均能诱导产生高效价的IgG抗体及其亚型IgG1和IgG2a，抗体效价与BCG免疫组小鼠差异无统计学意义（ P>0.05）。EPRHP014f组诱导产生的分泌IFN-γ和IL-4的斑点形成细胞（SFC）数量均高于EPRHP014m组和BCG组（ P<0.05），而EPRHP014m组和BCG组的IFN-γ和IL-4的SFC数量差异无统计学意义（ P>0.05）。EPRHP014m组诱导分泌的GM-CSF、IL-12p70均高于BCG组（ P<0.05），而IL-6和IL-10分泌水平与BCG组的差异无统计学意义（ P>0.05）；EPRHP014f组和BCG组的IL-6、IL-10、IL-12和GM-CSF分泌水平差异无统计学意义（ P>0.05）。EPRHP014m组、EPRHP014f组和BCG组具有明显的体外抑菌作用，差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论:EPRHP014f和EPRHP014m免疫后均能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答，且有较强的体外抑制结核分枝杆菌生长的能力，显示抗原组合物EPRHP014具有良好的结核疫苗研发和应用价值。

目的 探究小檗碱对结核分枝杆菌抗原持续刺激致T细胞耗竭的影响.方法 应用结核抗原持续刺激小鼠模拟临床结核分枝杆菌慢性感染病理过程:卡介苗感染C57BL/6小鼠1周后,使用结核抗原ESAT6-CFP10(EC)和Mtb10.4-HspX(MH)持续刺激4次,每次间隔1周,建立T细胞耗竭模型.利用该模型进行干预治疗:结核抗原刺激期间每天给予不同剂量小檗碱灌胃治疗,末次抗原刺激后1周,流式细胞术检测抗原特异性T细胞分泌γ干扰素的水平和脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞表面抑制性受体PD-1的表达;ELISA检测血清中γ干扰素的水平;生化试剂盒检测脾脏淋巴细胞糖酵解代谢产物丙酮酸和乳酸的浓度;小檗碱体外作用于Jurkat T细胞后检测丙酮酸和乳酸的浓度.结果 结核抗原持续刺激致抗原特异性T细胞分泌γ干扰素的水平降低(P＜0.05),CD4+和CD8+T细胞表达PD-1增多(P＜0.05),提示发生T细胞耗竭.不同剂量的小檗碱治疗后,减弱了T细胞的持续活化,血清γ干扰素水平降低(P＜0.01),CD4+和CD8+T细胞PD-1表达减少(P＜0.05).体外实验表明小檗碱抑制Jurkat T细胞的糖酵解(P＜0.01).结论 结核抗原持续刺激诱导T细胞耗竭,而小檗碱治疗可抑制T细胞的糖酵解,调节T细胞活化,预防T细胞耗竭.

研制安全有效的结核疫苗一直是结核病研究的重点,因此,有必要对其主要致病菌结核分枝杆菌(Mycobacteri-tmtuberculosis,Mtb)抗原进行科学合理的评价.本文综述了潜伏性结核感染重要抗原HspX的致病机制及其在结核疫苗研制中的应用进展,探讨了HspX抗原在不同类型疫苗研制中的作用,旨在为将来研制有效的结核疫苗提供较准确的信息.

目的 应用生物信息学预测分析Hrp1蛋白结构功能和生物学特性.方法 生物信息学软件ORF Finder、SO-SUI、Protpapram、ProtScale、Signal IP、Tmpred、TMHMM、NetNGlyc、NetPhos-3.1-Servera、PSORT、WoLF PSORT、TargetP-2.0-CBS、NLStradamus、SOMPA、SWISS-MODEL、IEDB、SYFPEITHI、RANKPEP、BLAST、DNAStar、STRING对Hrp1蛋白的理化性质、结构功能、生物学特性、抗原表位及蛋白相互作用进行预测分析.结果 Hrp1蛋白原子总数2166,等电点4.96,不稳定性指数19.62,脂肪族氨基酸指数100.35,平均疏水性0.042,有跨膜区无信号肽,1个糖基化位点6个磷酸化位点,二级结构以α-螺旋为主.其亚细胞定位于细胞质,属于稳定的亲水性蛋白.经预测,Hrp1蛋白含有4个B细胞表位,多个T细胞表位,且其相互作用蛋白分别为Rv2627c、Rv2628、Rv1738、devR、Rv2624c、TB31.7、rip3、pfkB、guaA、hspX,并参与多种生物学过程.结论 生物信息学分析Hrp1蛋白为稳定亲水性胞浆蛋白,具有良好的抗原表位,为结核病诊断及治疗的潜在候选因子,是探索结核分枝杆菌持久性感染机制的重要研究靶标,可作为抗结核多肽疫苗的候选蛋白.

目的 比较不同耐药型的结核分枝杆菌(MTB)热休克蛋白基因hspX序列与表达,初步探讨hspX与MTB的耐药是否存在相关性.方法 选取 4 种一线抗结核药物全部敏感株(S)、同时对异烟肼和利福平耐药(MDR)和一种耐药[单耐利福平(MTBR+)、单耐异烟肼(MTBH+)、单耐链霉素(MTBS+)和单耐乙胺丁醇(MTBE+)]的菌株各 10 株,采用改良的十二烷基苯磺酸钠裂解法和TRIzol法分别提取各组菌株的DNA和RNA,使用特异性引物进行PCR和实时荧光定量PCR确定hspX基因的存在及其表达.对 PCR 产物进行测序以检查正向和反向的多态性,并用DNAman软件进行与标准株H37Rv序列比对.以敏感菌株(S)组为对照组进行两两对比分析不同耐药型的MTB菌株hspX表达的差异.结果 PCR成功获得各组特异性的hspX基因,与H37Rv序列比对具有 97％～99％的同一性,无存在明显差异;以相对定量 2-ΔΔCt法计算获得S、MDR、MTBR+、MTBH+、MTBS+和MTBE+菌株hspX的表达分别为 0.98(0.89,1.23)、1.49(1.10,2.04)、1.41(0.55,2.80)、1.37(0.68,2.71)、0.91(0.59,1.62)和 0.70(0.48,1.18).以敏感菌株(S)组为对照组,不同耐药型菌株组与其比较,hspX表达差异均无统计学意义(P均＞0.05).结论 hspX基因在MTB中是保守的.在自然状态下,hspX基因在MTB的耐药性方面无明显相关性.

目的 分析HspX蛋白的基本性质及其编码基因对大肠埃希菌(E.coli)生长的影响,为将其作为结核病疫苗候选分子和临床检测生物标志物的可行性提供实验依据.方法 应用生物信息学方法分析HspX蛋白基本生化性质;构建原核重组表达载体并在E.coli中表达,用金属螯合层析法纯化HspX蛋白,观察该蛋白及其编码基因对宿主菌E.coli-BL21(DE3)和E.coli-DH5α生长的影响.结果 生物信息学分析HspX蛋白由144个氨基酸残基组成,相对分子质量为16.227 28×103,等电点为5.00;该蛋白无信号肽,含有14个磷酸化位点,为亲水性细胞壁蛋白.其在大肠埃希菌中以可溶性表达,经镍金属螯合填料一步纯化得到纯度为86.9％的重组蛋白.重组质粒(pET28a-Rv2031c)能显著抑制其表达宿主菌E.coli-BL21(DE3)的生长,但不会抑制其克隆宿主菌E.coli-DH5α的生长.结论 HspX蛋白能抑制E.coli-BL21(DE3)宿主菌的生长,其可能是结核分枝杆菌在宿主体内滞留发挥作用的效应物之一.