目的:对引发2022年5月山东省荣成市COVID-19疫情的SARS-CoV-2进行全基因组测序，分析核苷酸和氨基酸变异情况并进行溯源。方法:应用高通量测序技术对15份来源于某水产进口公司相关COVID-19聚集性病例鼻咽拭子样本和3份环境样本进行病毒全基因组测序。使用病毒序列和变异分析软件，对测序原始数据进行全基因组序列拼接和变异位点分析并对病毒进行分型，利用进化分析软件构建系统发育树，并结合病例流行病学调查结果，追溯病毒的潜在来源。结果:成功获得13条来源于病例样本的SARS-CoV-2全基因组序列，长度为29 653~29 780 bp，平均测序深度为1 756~6 565 X，基因组覆盖度为99.20%~99.63%；Pangolin分型结果显示13个SARS-CoV-2基因组均属于VOC/Gamma(P.1.15)分支；与武汉参考株(NC_045512.2)相比，13条SARS-CoV-2全基因组序列分别存在40~41个核苷酸突变位点；在7个蛋白质结构域(ORF1a、ORF1b、S、ORF3a、ORF8、ORF9b及N蛋白)，存在23~24个氨基酸变异位点。进化分析显示该病毒序列与来自阿根廷的参考株(EPI_ISL_4082233)共处于同一子分支上。结论:本研究从荣成市一起冷链进口水产关联的COVID-19聚集性疫情病例样本中测序获得13个Gamma变异株全基因组序列，及时将病毒来源指向于2021年的南美进口海鲜。本研究所采用的测序方法和分析结果可以为SARS-CoV-2的变异分析和病例溯源提供参考，也提示我们SARS-CoV-2在冷链物品表面的存活与传播能力不容小觑，有待进一步探索。

目的:分析与先天性心脏缺损(congenital heart defect，CHD)相关的 ISL1基因变异及其功能特点。 方法:收集194例CHD患者和232名正常对照的临床资料和外周血样，提取基因组DNA。测序分析全部对象的 ISL1基因的编码外显子及侧翼的部分内含子。构建野生型 ISL1基因表达质粒ISL1-pcDNA3.1，通过定位诱变获得相应的变异体。应用脂质体将基因表达质粒转染CHO细胞，应用双荧光素酶报告基因分析试剂研究变异型ISL1的功能特性。 结果:在1例散发性房间隔缺损患者中检测出1种新的杂合性 ISL1基因变异c.499C>T(p.Q167X)。功能研究表明变异型ISL1对靶基因 MEF2C启动子的转录激活功能丧失。 结论:发现了一个与CHD相关的 ISL1基因新变异， ISL1基因的缺陷可能为部分CHD的分子病因。

目的:基于扩增子技术结合高通量测序技术和生物信息分析技术，构建青海省猴痘病毒基因组测序、病毒变异分析及病例分子溯源方法，为今后青海省猴痘疫情防控提供技术支撑。方法:以猴痘病毒核酸阳性样本DNA为模板，利用Ampliseq扩增子技术进行全基因组靶向扩增并构建测序文库，利用Ion Torrent GeneStudio S5二代测序仪及其内置软件完成猴痘病毒全基因组测序、数据优化、变异分析及序列拼接，获得一致性序列。使用在线分析工具进一步分析病毒变异和基因组谱系分型，构建进化树进一步分析病例病毒潜在来源。结果:皮疹拭子和口咽拭子样本猴痘病毒基因核酸检测Ct值分别为32.13和36.91，皮疹拭子样本经猴痘病毒全基因组测序后获得一条高质量有效序列，reads数匹配率为99.99%，测序平均深度12 370×，基因组覆盖度为99.4%，序列属于IIb(西非分支)B.1.3型，存在86处核苷酸突变位点，引起41个氨基酸突变。变异分析和系统进化树分析结果显示，与GISAID猴痘病毒数据库中国云南、日本近期提交的共4条猴痘病毒基因组序列在同一分支，与中国云南提交的序列EPI_ISL_18059184(2023-07-03采样)进化关系最近，共享82个核苷酸突变位点，其中云南序列仅存在共享的全部82个突变位点，本研究序列在共享82个核苷酸突变位点的基础上增加2个核苷酸突变位点；与日本提交的序列EPI_ISL_17692269(2023-04-28采样)进化关系较近，共享78个核苷酸突变位点，存在7个核苷酸突变位点差异，日本序列在共享78个突变位点的基础上增加1个核苷酸突变位点(G57786A)，本研究序列则增加6个核苷酸突变位点(G13563A、C21062T、G101241A、C142797T、G152866A、T169721A)。结论:从一例核酸检测Ct值较低的样本中获得一条全长197 084 bp的猴痘病毒全基因组有效序列，成功构建了青海省基于Ampliseq扩增子技术的猴痘病毒全基因组测序、病毒变异和分子溯源方法。

目的:分析及验证ISL1基因在心肌梗死中的表达，挖掘其在心肌梗死中的作用机制。方法:通过对GEO数据库中芯片表达谱数据进行分析找到ISL1基因在心肌梗死中的表达特征，以及ISL1基因高度共表达的相关基因及富集的通路功能，纳入急性心肌梗死患者及其健康对照，采用RT-PCR方法验证ISL1、GRIN2D等基因的表达。结果:ISL1基因在心肌梗死样本的表达量高于对照组样本。GSE59867和GSE29111两个数据集中，top2000、top2500、top3000的相关性基因交集分别共有152个、231个、329个。共表达基因功能注释交集基因发现，交集基因与胚胎时期器官发生发育、基质蛋白的形成、上皮细胞的分化以及相关信号通路的活动密切相关。最后，ISL1相关ceRNA调控网络构建中，有12个基因位于ISL1 top2000的相关性交集中，与miRNA共参与形成21对miRNA-mRNA。并且通过多个队列找出其关键的调控基因为GRIN2D，该基因与ISL1竞争性结合多个miRNA且表达量在两个独立数据集中呈现高度负相关( r＝－0.52，－0.41)。RT-PCR结果发现急性心肌梗死组miR-128-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p表达水平低于对照组，ISL1、GRIN2D表达水平高于对照组(均 P<0.01)。 结论:ISL1可能通过参与基质蛋白的形成、上皮细胞的分化以及相关信号通路的活动，对心肌梗死发挥保护作用。

背景:第二生心区对于胚胎心脏发育具有重要意义,其发育异常会导致多种心脏畸形,Cx43基因敲除后第二生心区细胞的形成和增殖减少,但具体原因尚未明确.目的:①明确β-catenin、Smo以及Cx43在内胚层与第二生心区的表达模式,观察其有无共表达;②探究Cx43与Wnt/β-catenin通路或Shh通路之间是否存在相互作用,共同参与第二生心区的发育.方法:选取胚龄10-12 d的ICR小鼠胚胎石蜡包埋连续切片,进行免疫组织化学染色、苏木精-伊红染色、免疫荧光染色;剥离胚龄11 d小鼠胚胎的原始消化管用于蛋白印迹实验和免疫共沉淀.结果与结论:①胚龄10-12 d,Cx43与Isl1在前肠腹侧和心包腔背侧壁的部分间充质细胞呈共表达,Isl1阳性细胞增多的同时Cx43阳性细胞也增多;②胚龄10-12 d,Cx43与β-catenin在内胚层腹侧共表达;③胚龄10-12 d,Cx43与Smo在内胚层上共表达;④免疫共沉淀结果表明Cx43与β-catenin之间存在相互作用,共同参与第二生心区的发育.

目的 构建POMC神经元上Isl1 基因条件性敲除小鼠模型,并初步分析其表型.方法 利用Cre/loxP系统构建条件性基因敲除小鼠模型,通过Isl1flox/+自交获得Isl1flox/flox小鼠,再将Isl1flox/flox小鼠与POMCCre基因型小鼠交配得到POMCCre;Isl1flox/+雄鼠,POMCCre;Isl1flox/+雄鼠再与Isl1flox/flox雌鼠交配,通过PCR进行基因型鉴定,得到POMC神经元上Isl1 条件性敲除小鼠(POMCCre;Isl1flox/flox,缩写为Isl1△POMC),免疫印迹法验证其敲除效率.通过功能学及组织病理学方法,观察主要组织器官是否存在自发病变.结果 成功构建了Isl1△POMC小鼠,Isl1△POMC小鼠下丘脑弓状核中ISL1 敲除效率＞90%(P＜0.05),其他组织中ISL1 表达水平无变化(P>0.05),证明POMC神经元Isl1 基因敲除小鼠模型构建成功.Isl1△POMC小鼠呈现青春期后自发性进行性肥胖、代谢综合征及生育能力障碍等表型.结论 应用 Cre/loxP技术成功构建了POMC神经元Isl1 基因条件性敲除小鼠,为研究Isl1 在POMC神经元中生物学功能和调控机制提供了重要的动物模型.

目的 获得瑞香狼毒Stellera chamaejasme转录组数据库代谢途径基因序列、SSR以及转座子等信息.方法 以瑞香狼毒根作为受试材料,采用二代测序方法中的Illumina HiSeq 2000进行转录组测序,并进行系统的生物信息学分析.结果 共获得26 785 872个Clean reads片段,拼接得到47 053条Unigenes,平均长度为419nt.将拼装所得到的Unigene序列利用BLAST工具分别与Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO数据库进行比对,分别有11 138和24 744条Unigene在Nr和Swiss-Prot数据库中比对得到了注释信息,可归于36个GO分类,涉及119个KEGG标准代谢通路,进一步分析发现15条萜类生物合成途径的关键酶基因.利用MISA软件发现3 480个SSR,数量最高的SSR类型为单碱基重复,为1 986条,出现频率为57.07％,最少的是六碱基重复SSR,只有5条,出现频率仅为0.14％.利用RepeatMasker在线工具针对瑞香狼毒转录组序列进行转座子预测分析,结果共发现有1 497条转座子,其中E值＜1×10-5的序列有827条,包含22种类型转座子,数目最多的为LINE/L1类型(405条),占比为48.97％,占比最少的为DNA/Ginger、DNA/hAT、DNA/PIF-ISL2EU和LINE/Jockey以及LTR/Lenti类型分别只有1条.结论 对瑞香狼毒进行高通量测序,获得了大量基因序列信息以及SSR和转座子信息,为今后分离克隆瑞香狼毒中佛波酯等有效成分生物合成的关键酶基因以及开展相关分子机制研究提供了数据资源和理论基础.

目的:克隆含人胰岛因子1 (islet1,ISL1)基因上游启动子序列的质粒并检测其在人胚肾HEK-293细胞中的启动子活性.方法:以HEK-293细胞提取的DNA为模板,PCR扩增ISL1基因启动子区全长1 419 bp片段;酶切后将此片段连接至pGL3-Basic载体,克隆含有ISL1基因启动子片段的重组质粒;以此重组质粒为模板重复上述步骤构建一系列ISL1启动子5'侧翼区截短质粒.将含ISL1启动子序列的重组质粒及其截短质粒转染至人胚肾HEK-293细胞,双荧光素酶报告基因检测各片段的启动子活性,找出启动子最小活性区域,并通过生物信息学方法分析转录因子结合位点.结果:经酶切、测序鉴定,成功构建含有ISL1启动子序列的重组质粒及其截短质粒.与pGL3-Basic空载体相比,含有ISL1启动子序列的重组质粒启动子活性明显增加(P＜0.01).ISL1最小活性区域位于转录起始位点-173 bp至-1 bp之间,其中包含OCT-1、MYOD、E2F2等多个转录因子结合位点.结论:人ISL1转录起始点上游1 215 bp区域在HEK-293细胞中具有较强启动子活性.

目的 探讨转录因子Tbx3在小鼠胚胎第二生心区(SHF)的时空表达模式,为其对SHF的调节作用提供形态学依据.方法 40只胚龄9～15d小鼠胚胎心脏连续石蜡切片,用抗胰岛素基因增强子结合蛋白l(ISL-1)抗体、抗心肌肌球蛋白重链(MHC)抗体、抗心肌肌球蛋白轻链Ⅱa(MLC2a)抗体、小鼠抗增殖细胞核抗体(PCNA)、抗Tbx3抗体进行免疫组织化学和免疫荧光双标染色.结果 胚龄9d,咽腹侧内胚层增厚,且表达Tbx3与SHF标记物ISL-1.胚龄10～12 d,咽腹侧间充质出现ISL-1阳性细胞并逐渐增多,部分细胞共表达Tbx3.动脉囊壁、心包腔背侧壁以及流出道远端壁也可见ISL-1表达,Tbx3在这些部位均呈阴性.心背侧间充质突(DMP)内可见ISL-1、Tbx3散在表达.胚龄13 ～ 15 d,DMP逐渐心肌化,同时可见Tbx3阳性细胞分布.结论 Tbx3在SHF的表达集中在咽腹侧间充质,可能参与调节SHF前体细胞的存在与增殖;但在后第二生心区(pSHF)的作用与在动脉端的SHF可能不同.

目的 研究磷酸西格列汀对T2DM大鼠肝细胞自噬的影响.方法 采用高脂、高糖饮食配合45 mg/kg STZ饲喂法建立T2DM大鼠模型.建模成功后将大鼠随机分组,分别用10 m/kg西格列汀灌胃(SGT组)、PBS灌胃(T2DM组)及10 IU/(kg·d)胰岛素腹腔注射(ISL组).PBS灌胃的正常大鼠作为正常对照组(NC).12周后测定血糖水平.HE、Masson染色评估肝纤维化程度;TUNEL法检测肝细胞损伤状况;采用RT-PCR测定ATG3、ATG12、p62与Beclin1 mRNA的表达;采用半定量Western blot测定ATG3、ATG12、p62,Beclin1和LC3B的蛋白水平.结果 西格列汀治疗12周后,与T2DM组比较,SGT组血糖降低(P<0.05).HE、Masson染色结果表明,SGT组肝纤维化程度改善.与NC组比较,T2DM组肝组织中自噬相关基因变化差异无统计学意义;T2DM组中ATG3、ATG12、p62、Beclin1的mRNA的表达量分别为(0.82±0.12)、(0.66±0.03)、(0.12±0.01)和(0.52±0.02);SGT组中各基因表达量分别为(1.62±0.11)、(0.89±0.03)、(1.35±0.06)和(0.87±0.11),组间比较,差异有统计学意义(P<0.05).半定量Western blot结果显示,SGT组肝组织中ATG3、ATG12、p62、Beclin1和LC3 B蛋白的表达水平均增加.结论 磷酸西格列汀可能通过促进肝组织自噬水平来减轻T2DM大鼠肝纤维化程度.