目的:探究多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）小鼠卵母细胞中miR-320-3p低表达对胚胎发育潜能的影响，并初步探讨相关分子机制。方法:脱氢表雄酮皮下注射法构建40只PCOS小鼠模型，40只对照组小鼠注射等量油剂。通过发情周期变化和卵巢组织苏木素-伊红染色，评估模型构建效果，超数排卵获取模型鼠的M II期卵母细胞，胞质内注射miR-320-3p模拟物（miR-320-3p mimics）或阴性对照物（negative control，NC），分为对照+NC组、PCOS+NC组、PCOS+miR-320-3p mimics组。①通过qRT-PCR方法检测三组小鼠M Ⅱ期卵母细胞中miR-320-3p的表达；②三组M Ⅱ期卵母细胞行卵胞质内单精子注射，收集双原核（two pronuclei，2PN）受精卵进行体外培养，于受精后48 h、84 h记录4-细胞期胚胎和囊胚的数量。③三组囊胚分别进行滋养外胚层分子标志物CDX2染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记法细胞凋亡检测，统计各组总细胞数、滋养外胚层（trophectoderm，TE）细胞数、内细胞团（inner cell mass，ICM）细胞数和凋亡细胞数；④通过qRT-PCR方法检测三组4-细胞胚胎中miR-320-3p的靶基因（ Ulk1、 Pbx3、 Kdm5b、 Satb2）及发育相关基因（ Pou5f1、 Myc、 Klf4、 Ago2、 Dppa3、 Wdr5）的表达变化。 结果:①qRT-PCR显示，与对照+NC组相比，PCOS+NC组小鼠卵母细胞中miR-320-3p表达相对下调，差异具有统计学意义（ P=0.009）；PCOS+miR-320-3p mimics组中miR-320-3p表达量显著多于PCOS+NC组（ P=0.002）；对照+NC组与PCOS+miR-320-3p mimics组组间差异无统计学意义（ P=0.146）。②对照+NC组、PCOS+NC组、PCOS+miR-320-3p mimics组的4-细胞率组间差异均无统计意义（均 P>0.05）；三组囊胚形成率分别是75.89％（85/112）、59.22％（61/103）、72.64％（77/106），与对照+NC组相比，PCOS+NC组囊胚率显著降低（ P=0.009）；与PCOS+NC组相比，PCOS+miR-320-3p mimics组囊胚率显著升高（ P=0.041）。③对照+NC组、PCOS+NC组、PCOS+miR-320-3p mimics组囊胚的总细胞数分别是85.81±9.26、67.29±7.07、82.71±8.40，TE细胞数分别是69.19±7.01、52.38±6.34、65.38±8.30，ICM细胞数分别是17.62±3.60、14.90±2.39、17.29±3.90，凋亡细胞数分别是8.64±2.80、11.73±2.07、9.55±2.81，凋亡率分别是9.64%±2.78%、16.68%±2.81%、11.18%±2.61%。对照+NC组囊胚的总细胞数、TE及ICM细胞数均显著多于PCOS+NC组（ P<0.001、 P<0.001、 P=0.011），凋亡细胞数、凋亡率均显著低于PCOS+NC组（均 P<0.001）；PCOS+miR-320-3p mimics组总细胞数、TE及ICM细胞数也均显著多于PCOS+NC组（ P<0.001、 P<0.001、 P=0.025），凋亡细胞数、凋亡率均显著低于PCOS+NC组（ P=0.007、 P<0.001）。对照+NC组与PCOS+miR-320-3p mimics组组间囊胚的总细胞数、TE及ICM细胞、凋亡细胞数、凋亡率差异均无统计学意义（均 P>0.05），三组TE/ICM的比值组间差异无统计学意义（ P>0.05）。④与对照+NC组相比， Ulk1、 Pbx3、 Myc、 Dppa3在PCOS+NC组4-细胞胚胎中相对表达下调（ P=0.012、 P=0.002、 P<0.001、 P=0.001）， Kdm5b、 Satb2相对表达上调（ P<0.001、 P<0.001）；与PCOS+miR-320-3p mimics组相比， Ulk1、 Pbx3、 Myc、 Dppa3在PCOS+NC组4-细胞胚胎中相对表达下调（ P=0.005、 P=0.001、 P=0.001、 P=0.004）， Kdm5b、 Satb2相对表达上调（ P<0.001、 P=0.001），对照+NC组与PCOS+miR-320-3p mimics组组间差异均无统计学意义（均 P>0.05）；与对照+NC组相比， Wdr5在PCOS+NC组和PCOS+miR-320-3p mimics组中相对表达均上调（ P=0.001、 P=0.003），PCOS+NC组与PCOS+miR-320-3p mimics组中差异无统计学意义（ P>0.05）。 Pou5f1、 Klf4、 Ago2在三组间差异均无统计学意义（均 P>0.05）。 结论:PCOS小鼠卵母细胞中miR-320-3p低表达影响胚胎植入前的囊胚形成率和囊胚质量，PCOS卵母细胞中补偿miR-320-3p能够改善胚胎发育潜能，提高胚胎质量。

目的:分析赖氨酸特异性去甲基化酶6B（KDM6B）在乙型肝炎相关性肾炎（HBV-GN）患者肾组织及乙型肝炎病毒X基因（HBx）转染的人足细胞中的表达，及其在HBx介导的足细胞-巨噬细胞转分化（PMT）中的作用。方法:选取2013至2018年在上海交通大学附属第一人民医院经肾穿刺活检病理诊断为HBV-GN的48例患者肾活检标本，以30例原发性肾小球肾炎（PGN）肾活检标本及15例肾肿瘤患者癌旁正常肾组织作为对照。利用免疫荧光及免疫组化法观察HBV-GN患者肾组织KDM6B及巨噬细胞标志物F4/80的表达。分析肾组织KDM6B表达水平与HBV-GN患者临床特征的关系。Western印迹法检测足细胞中KDM6B、F4/80、主要组织相容性复合体Ⅱ（MHC-Ⅱ）以及共刺激分子CD40的表达；ELISA法测定细胞上清中γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-6的含量；同时利用KDM6B小干扰RNA（siRNA）沉默HBx质粒转染的人足细胞中KDM6B基因表达后，Western印迹法检测细胞中KDM6B、F4/80及组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）的表达变化。结果:与正常对照组相比，HBV-GN患者肾组织KDM6B表达增加（0.022±0.004比0.006±0.002， P=0.006）。HBV-GN不同病理类型组间KDM6B阳性率差异无统计学意义（ P=0.139）。此外，在HBV-GN患者足细胞中可观察到KDM6B和F4/80的共表达。估算肾小球滤过率（eGFR）<60 ml·min -1·（1.73 m 2） -1或尿蛋白≥3.5 g/d的患者肾组织KDM6B表达分别高于eGFR≥60 ml·min -1·（1.73 m 2） -1或尿蛋白<3.5 g/d的患者（均 P<0.05）。HBx转染人足细胞后KDM6B、F4/80、MHC-Ⅱ以及CD40表达均上调（均 P<0.05），上清IFN-γ和IL-6含量均增加（均 P<0.05）；将KDM6B基因沉默后，HBx所诱导的足细胞F4/80表达下调，H3K27me3表达则上调（均 P<0.05）。 结论:HBx可通过诱导足细胞KDM6B表达启动PMT，可能参与HBV-GN局部组织免疫微环境紊乱的发生。

目的 研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化过程中转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)/Smad信号通路与组蛋白甲基化酶和去甲基化酶的相关性.方法 BMSCs成骨诱导培养,用TGF-β1、SB431542 和TGF-β1+SB431542 干预.分为 4 组:BMSCs-Ctrl-3d组(A 组),BMSCs-Ctrl-ost3d 组(B 组),BMSCs-TGF-β1-ost3d 组(C 组),BMSCs-TGF-β1-SB1UM-ost3d组(D组).用qRT-PCR方法检测各组甲基化酶和去甲基化酶mRNA表达量.结果 (1)与A组比较,B组DM3B、KDM4A、KDM4B、KDM4C、KDM4D、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM6A、KDM6B、EZH1 的mRNA表达明显增强(P＜0.05).(2)与 B 组比较,C 组 KDM3B、KDM4A、KDM4C、KDM4D、KDM5C、EZH1 的mRNA表达明显降低(P＜0.05);KDM5B、KDM6A、KDM6B的mRNA表达明显增强(P＜0.05);而KDM4B、KDM5A表达无明显改变(P＞0.05).(3)与C组比较,D组KDM3B、KDM6A、KDM6B的mRNA表达发生明显改变(P＜0.05);KDM4C、KDM4D、KDM5C和EZH1 的mRNA改变不显著(P＞0.05),KDM4A的mRNA发生非特异性改变(P＜0.05).结论 TGF-β1 通过TGF-β1/Smad信号通路和TGF-β1/非Smad信号调控部分相关组蛋白甲基化转移酶/去甲化酶的表达,从而促进了BMSCs成骨分化.

赖氨酸去甲基化酶5C(lysine demethylase 5C,KDM5C)可以催化组蛋白H3上第4位赖氨酸残基二甲基和三甲基(histone H3 lysine 4 di-/trimethylation,H3K4me2/3)去甲基化为H3K4me1.KDM5C主要在人的大脑和骨骼肌中表达,其编码的蛋白质参与各种生物学效应.KDM5C与X连锁智力迟钝有关,在神经系统疾病中发挥重要作用;KDM5C在肿瘤中是一把双刃剑,具有促癌和抑癌的特性.KDM5C在前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、膀胱癌、肝细胞癌、食管癌、鼻咽癌、胃癌、肺癌和弥漫性大B细胞淋巴瘤中过表达并促进肿瘤生长,在肝内胆管癌、子宫颈癌、套细胞淋巴瘤和甲状腺乳头状癌中低表达,在肾透明细胞癌和前体B细胞急性淋巴细胞白血病中易失活突变,并与不良预后相关,在乳腺癌中发挥双重作用.本文就KDM5C在疾病中的功能研究做一简述.

目的:通过MeRIP联合逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)技术,证明WTAP介导的RNA m6A修饰对伴t(8;21)急性髓系白血病(AML)细胞中KDM4B基因的直接调控作用.方法:采用靶向WTAP或KDM4B基因的短发夹 RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体沉默 t(8;21)AML 细胞系 Kasumi-1 和 SKNO-1 中 WTAP 或KDM4B基因表达,以转染随机打乱序列(scramble)的shRNA的细胞为对照.用超纯RNA提取试剂盒(DNase Ⅰ)提取细胞RNA,Magna MeRIPTM m6A Kit试剂盒富集甲基化修饰片段,并通过RT-qPCR检测m6A甲基化修饰的RNA区域;采用蛋白免疫印迹实验(Western blot)和逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)技术检测细胞中WTAP、KDM4B蛋白和mRNA的表达水平.采用克隆形成实验检测细胞体外克隆形成能力.结果:沉默Kasumi-1细胞中WTAP的表达后,m6A甲基化修饰在KDM4B mRNA 3'UTR的富集程度显著下降(P＜0.01),沉默Kasumi-1和SKNO-1细胞中WTAP的表达可显著抑制KDM4B蛋白(P＜0.001)和mRNA表达水平(Kasumi-1:P＜0.001;SKNO-1:P＜0.01)、细胞体外克隆形成能力下降(Kasumi-1:P＜0.001;SKNO-1:P＜0.01).结论:t(8;21)AML细胞系中,WTAP通过调控KDM4B基因mRNA 3'UTR的m6A修饰调控KDM4B的表达,沉默KDM4B表达可以抑制t(8;21)AML细胞增殖.

目的:组蛋白修饰是表观遗传调控的一种重要形式.其中,组蛋白甲基化是染色质状态的关键决定因素.组蛋白H3第36位赖氨酸三甲基化产物(histone H3 trimethylation at lysine 36,H3K36me3)可以介导多种转录相关事件,有助于DNA损伤修复.组蛋白赖氨酸三甲基转移酶SET结构域2(SET domain containing 2,SETD2)、赖氨酸特异性去甲基化酶4B(lysine-specific demethylase 4B,KDM4B)分别是H3K36me3甲基转移酶及去甲基酶,SETD2失活及KDM4B活化均可下调H3K36me3水平从而促进肿瘤的发生和发展.本研究主要探讨H3K36me3、SETD2、KDM4B在结直肠癌中表达的临床病理意义.方法:收集2018年10月至2020年10月就诊于福建中医药大学附属人民医院的80例结直肠癌患者术后石蜡包埋的组织样本.采用免疫组织化学染色法检测H3K36me3、KDM4B、SETD2及4种错配修复(mismatch repair,MMR)蛋白质(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2)在结直肠癌及正常肠黏膜中的表达水平.采用多重荧光PCR-毛细管电泳检测结直肠癌及正常肠黏膜的微卫星状态,分为微卫星高度不稳定性(microsatellite instability-high,MSI-H)组与微卫星稳定(microsatellite stable,MSS)组,检测2组结直肠癌中H3K36me3及SETD2、KDM4B、MMR蛋白质表达情况并分析其临床病理意义.结果:STED2、H3K36me3表达与结直肠癌发生呈负相关(分别为r=-0.745,P<0.001;r=-0.160,P<0.05),KDM4B表达与结直肠癌发生呈正相关(r=0.660,P<0.001).不同的患者性别、年龄,不同的肿瘤发生部位、大体类型、肿瘤最大径、浸润深度、淋巴结转移的临床病理参数之间SETD2及H3K36me的表达差异均无统计学意义(均P>0.05),除在不同的肿瘤浸润深度KDM4B的表达差异有统计学意义(χ2=0.349,P<0.05)外,在其他临床病理参数上KDM4B的表达差异均无统计学意义(均P>0.05).结直肠癌样本中检测出14例为MSI-H结直肠癌、66例为MSS结直肠癌;SETD2及H3K36me3的表达均与结直肠癌微卫星状态相关(分别为χ2=3.916,P<0.05及χ2=41.608,P<0.001);KDM4B的表达与结直肠癌微卫星状态无明显相关性(χ2=0.067,P>0.05).SETD2及H3K36me3表达与MSI-H结直肠癌发生呈负相关(分别为r=-0.221,P<0.05及r=-0.721,P<0.001).KDM4B表达与MSS结直肠癌发生呈正相关(r=0.200,P<0.05).免疫组织化学染色结果显示13 例(16.25%)为dMMR,67例(83.75%)为pMMR;PCR-毛细管电泳验证结果显示14例为MSI-H结直肠癌,其中13例为dMMR,1例为pMMR;66例为MSS结直肠癌.免疫组织化学染色与多重荧光PCR-毛细管电泳检测结果具有强一致率(Kappa= 0.955).结论:H3K36me3及其表观遗传修饰蛋白质SETD2和KDM4B蛋白质的不同表达程度与结直肠癌发生、发展具有相关性.

目的 明确组蛋白去甲基化酶5B(lysine-specific demethylase 5B,KDM5B)在喉癌中的表达情况,探讨其对喉癌Hep-2细胞增殖的影响及相关机制.方法 收集121例喉癌患者手术切除组织标本和60例癌旁组织标本,对KDM5B表达量进行免疫组化分析,了解KDM5B表达与各临床因素间的关系.设计重组KDM5B-shRNA干扰表达质粒,并转染入Hep-2细胞内.研究分为空白组、NC-shRNA组和KDM5B-shRNA组.qRT-PCR检测KDM5B mRNA表达水平,CCK-8法观察细胞增殖能力的变化,平板克隆形成实验观察单克隆集落的形成,流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡情况,Western-blot检测KDM5B、H3K4me3、p21、p27、CyclinD1、CDK4等蛋白的表达情况.结果 KDM5B在喉癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P=0.000),与病理类型(P=0.007)、临床分期(P=0.002)和淋巴结转移(P=0.000)均有关.KDM5B-shRNA组细胞内KDM5B mRNA水平明显低于空白组和NC-shRNA组(P＜0.01).随着转染时间的持续延长,KDM5B-shRNA组细胞的吸光度值与空白组和NC-shRNA组相比均有较大差异(P=0.000),且KDM5B-shRNA组细胞的单克隆集落数明显减少(P=0.000).KDM5B蛋白表达被抑制后,CyclinD1和CDK4蛋白表达随转染时间延长均逐渐减少,而H3K4me3、p21和p27蛋白表达量则均逐渐升高.与空白组和NC-shRNA组相比,KDM5B-shRNA组细胞的G1期分布明显升高,而S期和G2期分布比例均明显降低,细胞凋亡率也明显升高(P均=0.000).结论 KDM5B参与喉癌增殖的调控,可作为一个潜在治疗喉癌的靶点.

目的 研究胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)促进胶质瘤增殖的差异表达基因.方法 体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞分为3组,正常对照组(对照组)和实验组(GDNF 70μg·L-1干预6 h组和GDNF 70μg·L-1干预12 h组).利用全基因组表达谱芯片技术进行分析,实时定量PCR验证芯片结果,并对差异基因进行聚类分析和信号转导通路分析等.结果 与对照组比较,GDNF干预6 h组和GDNF干预12 h组分别上调772和664个基因,下调282和259个基因.其中,最显著的上调基因为NTN1、SLC7A5、NDST1、CD24、NFIC、KDM4A、CEACAM1、SOCS2.下调基因主要有Sctr、C4-2、GNAL、HSD3B1、Stfa2l1等.基于KEGG数据库进行生物学通路分析显示上调基因主要参与葡糖胺聚糖半乳糖基转移酶-硫酸盐肝素的生物合成、细胞的黏附连接、癌症的转录失活、JAK-STAT信号通路等.选取8个差异基因(CD24,CEACAM1、Synpo、Ndst1、Nfic、Ntn1、Socs2、Ccdc6)进行RT-PCR验证,GDNF干预12 h组与对照组比较,CEACAM1、Nfic、Socs2、Ccdc6基因表达倍数显著增加(P<0.05).提示差异基因的mRNA变化趋势与表达谱结果一致.结论 应用全基因组表达谱芯片并结合生物信息学软件分析差异表达基因,为GDNF促进胶质瘤细胞增殖的分子生物学机制的研究提供了依据.

目的:组蛋白H3赖氨酸9位(H3K9)的甲基化是造血和白血病发生中关键的表观遗传学修饰,由组蛋白甲基化酶和去甲基化酶精确调控.组蛋白H3K9去甲基化酶KDM3B则是一个潜在的白血病发生抑制基因.我们旨在探讨白血病中KDM3B的潜在靶基因.方法:干涉多个急性髓系白血病细胞株中的KDM3B基因后进行微阵列芯片实验,采用基因集富集分析(GSEA)及Venn分析数据,筛选出若干KDM3B潜在的靶基因,并用实时定量PCR对CDKN1A基因的结果进行验证.结果:对比GSEA的分子标签数据库中标志基因集(H)和已建立的基因集(C2),在NB-4和PLB-985细胞中(分别影响),与KDM3B正相关的基因分别有2 375和2 007个,其中P＜0.05的基因分别有89和67个;与KDM3B负相关的基因分别有1 882和2 250个,其中P ＜0.05的基因分别有62和67个,包括FLT3、NRAS、EVI1和IL4等基因.对比GSEA的分子标签数据库中染色体位置(C1)、已建立的基因集(C2)、模序(C3)、肿瘤相关基因集(C4)、GO基因集(C5)、致瘤基因集(C6)、免疫学基因集(C7)和标志基因集(H),在NB-4和PLB-985细胞中(共同影响),与KDM3 B正相关的基因有4 815个,其中P＜0.05的基因有130个;与KDM3B负相关的基因有4 400个,其中P＜0.05的基因有97个,包括POU5F1和CDKN1A等基因.干扰NB-4和PLB-985细胞中KDM3B基因的表达,我们选取影响最强的600个探针用Venn分析,在两种细胞系中表达均下降的基因有16个,包括血液病相关基因CCDN3、TRIM24、MAPKI3、SOX6等;在NB-4细胞中表达降低但在PLB-985细胞中表达升高的基因有17个,包括RARRES3和CD58等基因.实时定量PCR结果显示干扰PLB-985细胞中KDM3B后CDKN1A的表达是对照组的1.18倍.结论:KDM3B调控急性髓系白血病相关基因,CDKN1A是一个潜在的KDM3B靶基因.

目的:探讨微小RNA-29a(miR-29a)在前列腺癌细胞中的生物学功能及miR-29a过表达抑制前列腺癌细胞恶性表型的分子机制.方法:运用基因芯片和生物信息学技术检测并分析miR-29a在前列腺癌组织及癌旁组织中的表达;real-time PCR检测前列腺癌组织、癌旁组织、4种前列腺癌细胞(PC3、DU145、LNCaP和ArCaP)及正常前列腺细胞(RWPE-1)中miR-29a和赖氨酸(K)特异性去甲基化酶4B(KDM4B)mRNA的表达水平;采用瞬时转染法将pGenesil-1-miR-29a质粒转染上述4种前列腺癌细胞,MTT法、集落形成实验、Annexin V-FITC/PI及流式细胞术分别检测细胞活力、集落形成率和细胞凋亡率;Western blot检测KDM4B的蛋白表达.结果:基因芯片和生物信息学结果显示,miR-29a在前列腺癌组织和癌旁组织中存在差异表达;real-time PCR结果显示,分别与癌旁组织和RWPE-1细胞比较,miR-29a在前列腺癌组织和4种前列腺癌细胞中的表达水平均显著降低,而KDM4B的mRNA水平显著增高(P<0.05).与阴性对照(pGenesil-1)组比较,miR-29a过表达显著抑制4种前列腺癌细胞活力和集落形成,细胞凋亡率显著增加(P<0.05);Western blot结果显示,与pGenesil-1组比较,miR-29a过表达显著抑制KDM4B的蛋白表达.上调KDM4B的表达后,细胞活力明显升高,细胞凋亡率显著降低(P<0.05).结论:miR-29a在前列腺癌组织和细胞中低表达,miR-29a过表达抑制前列腺癌细胞生长,诱导细胞凋亡,其机制可能与抑制KDM4B的表达有关.