目的:分析赖氨酸特异性去甲基化酶6B（KDM6B）在乙型肝炎相关性肾炎（HBV-GN）患者肾组织及乙型肝炎病毒X基因（HBx）转染的人足细胞中的表达，及其在HBx介导的足细胞-巨噬细胞转分化（PMT）中的作用。方法:选取2013至2018年在上海交通大学附属第一人民医院经肾穿刺活检病理诊断为HBV-GN的48例患者肾活检标本，以30例原发性肾小球肾炎（PGN）肾活检标本及15例肾肿瘤患者癌旁正常肾组织作为对照。利用免疫荧光及免疫组化法观察HBV-GN患者肾组织KDM6B及巨噬细胞标志物F4/80的表达。分析肾组织KDM6B表达水平与HBV-GN患者临床特征的关系。Western印迹法检测足细胞中KDM6B、F4/80、主要组织相容性复合体Ⅱ（MHC-Ⅱ）以及共刺激分子CD40的表达；ELISA法测定细胞上清中γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-6的含量；同时利用KDM6B小干扰RNA（siRNA）沉默HBx质粒转染的人足细胞中KDM6B基因表达后，Western印迹法检测细胞中KDM6B、F4/80及组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）的表达变化。结果:与正常对照组相比，HBV-GN患者肾组织KDM6B表达增加（0.022±0.004比0.006±0.002， P=0.006）。HBV-GN不同病理类型组间KDM6B阳性率差异无统计学意义（ P=0.139）。此外，在HBV-GN患者足细胞中可观察到KDM6B和F4/80的共表达。估算肾小球滤过率（eGFR）<60 ml·min -1·（1.73 m 2） -1或尿蛋白≥3.5 g/d的患者肾组织KDM6B表达分别高于eGFR≥60 ml·min -1·（1.73 m 2） -1或尿蛋白<3.5 g/d的患者（均 P<0.05）。HBx转染人足细胞后KDM6B、F4/80、MHC-Ⅱ以及CD40表达均上调（均 P<0.05），上清IFN-γ和IL-6含量均增加（均 P<0.05）；将KDM6B基因沉默后，HBx所诱导的足细胞F4/80表达下调，H3K27me3表达则上调（均 P<0.05）。 结论:HBx可通过诱导足细胞KDM6B表达启动PMT，可能参与HBV-GN局部组织免疫微环境紊乱的发生。

目的:探讨在砷诱导肝细胞凋亡过程中，组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）水平对抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2（BCL2）基因表达的影响。方法:体外培养大鼠肝细胞BRL-3A，根据砷处理因素将实验分为两部分，未染砷时分为正常、转染试剂、阴性转染、JMJD3（H3K27me3特异性去甲基化酶）小干扰RNA（siRNA）转染、EZH2（H3K27me3甲基转移酶）siRNA转染组；染砷时分为对照、砷处理、砷+阴性转染、砷+ JMJD3siRNA转染、砷+ EZH2siRNA转染组。未染砷时siRNA和转染试剂按照100 pmol ∶ 7.5 μl比例转染细胞6 h[正常组加入与转染试剂同体积的磷酸盐缓冲液（PBS）]，再换培养基培养，共48 h；染砷时同上述方法转染和培养细胞24 h，染砷各组再加入终浓度为30 μmol/L的亚砷酸钠（NaAsO 2）处理24 h（对照组加入与NaAsO 2同体积的PBS处理24 h）。采用实时无标记细胞分析（RTCA）技术动态观察染砷时细胞增殖情况；流式细胞术检测染砷时细胞的凋亡情况；蛋白免疫印迹（Western blot）法检测未染砷时和染砷时细胞JMJD3、EZH2、H3K27me3、BCL2蛋白表达水平；染色质免疫共沉淀技术检测染砷时细胞BCL2基因启动子区H3K27me3的富集水平。 结果:对照、砷处理、砷+阴性转染、砷+ JMJD3siRNA转染、砷+ EZH2siRNA转染组细胞增殖率分别为（100.00 ± 10.43）%、（12.19 ± 3.37）%、（31.86 ± 1.95）%、（24.58 ± 3.64）%、（11.53 ± 1.11）%，细胞凋亡率分别为（1.15 ± 0.04）%、（13.06 ± 1.33）%、（17.39 ± 0.22）%、（23.90 ± 1.66）%、（15.07 ± 0.88）%，组间比较差异均有统计学意义（ F = 146.50、194.30， P均< 0.001）。JMJD3siRNA转染组H3K27me3蛋白表达水平均高于正常、转染试剂、阴性转染组，EZH2siRNA转染组则相反（ P均< 0.05）；JMJD3siRNA转染组BCL2蛋白表达水平均低于正常、转染试剂、阴性转染组，EZH2siRNA转染组则相反（ P均< 0.05），而在正常、转染试剂、阴性转染组之间，H3K27me3、BCL2蛋白表达水平均未见明显改变（ P均> 0.05）。在对照、砷处理、砷+阴性转染、砷+ JMJD3siRNA转染、砷+ EZH2siRNA转染组之间，JMJD3、EZH2、H3K27me3、BCL2蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义（ F = 26.56、7.82、9.81、31.19， P均< 0.05）。与对照组比较，砷处理组JMJD3、EZH2蛋白表达水平均较低，H3K27me3蛋白表达水平较高，同时BCL2蛋白表达水平较低（ P均< 0.05）；与砷+阴性转染组比较，砷+ JMJD3siRNA转染组JMJD3蛋白表达水平较低，砷+ EZH2siRNA转染组EZH2蛋白表达水平较低，砷+ JMJD3siRNA转染组H3K27me3蛋白表达水平较高，同时BCL2蛋白表达水平较低，而砷+ EZH2siRNA转染组则相反（ P均< 0.05）。与对照组比较，砷处理组细胞BCL2基因启动子区（CHIP1、CHIP2）H3K27me3的富集水平均较高（ P均< 0.05）。 结论:砷通过增加BCL2基因启动子区H3K27me3的富集水平，进而抑制BCL2的表达，促进肝细胞凋亡。

目的:探讨组蛋白去甲基化酶含Jumonji结构域的蛋白3（Jumonji domain-containing protein D3，JMJD3）在新生儿坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）肠道组织中的表达情况。方法:收集对照（先天性小肠闭锁）患儿及NEC患儿手术中切除的回肠组织进行RNA测序，筛选出差异基因。对差异基因进行组蛋白甲基化修饰酶相关基因聚类分析，筛选出目的基因赖氨酸特异性去甲基化酶6B[lysine（K）-specific demethylase 6B，KDM6B]，并采用实时荧光定量聚合酶链反应扩大样本量进行验证。蛋白免疫印迹和免疫组织化学检测JMJD3以及其底物组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（trimethylation of histone H3 at lysine 27，H3K27me3）在肠道组织中的蛋白表达情况。组间比较根据数据分布特点采用 t检验或Mann-Whitney U检验。 结果:RNA测序筛查出1 481条差异基因，其中643条基因上调，838条基因下调。筛查NEC肠道组织中30种组蛋白甲基化修饰酶的表达情况，其中KDM6B在NEC样本中差异表达最显著[Log 2（fold change）=0.769 104， P=0.009 009]。实时荧光定量聚合酶链反应结果显示，与对照组相比，KDM6B在NEC肠道组织中高表达（ P<0.05）；蛋白免疫印迹和免疫组织化学结果显示JMJD3蛋白水平在NEC肠道组织中明显增高，H3K27me3蛋白水平在NEC肠道组织中降低。 结论:在NEC肠道组织中组蛋白去甲基化酶JMJD3高表达，H3K27me3低表达。JMJD3可能通过降低H3K27me3的表达水平调控NEC的发生发展。

目的:探讨赖氨酸特异性去甲基化酶(lysine[K]-specific demethylase 6B,KDM6B)和叉头框蛋白 O1(forkhead box protein O1,FOXO1)在浆液性卵巢癌(serous ovarian cancer,SOC)中的表达水平及其与患者临床病理特征和预后的关系.方法:纳入我院妇科2018年04月至2023年04月收治入院接受手术治疗并经过病理证实的367例SOC患者和150例卵巢良性肿瘤患者.采用免疫组织化学法检测KDM6B、FOXO1蛋白在SOC组织中的表达水平,并分析二者表达水平与临床病理特征的关系.应用Pearson相关系数分析SOC组织中KDM6B与FOXO1蛋白表达的相关性.利用Kaplan-Meier法和Log-rank检验对不同KDM6B、FOXO1蛋白表达水平的SOC患者预后的差异进行比较.结果:KDM6B与FOXO1蛋白SOC组织中高表达率分别为48.77％和53.13％,显著高于正常卵巢组织的21.33％和32.00％(P均＜0.05).不同KDM6B蛋白表达水平的SOC患者在年龄、肿瘤分化程度、有无淋巴结转移、FIGO分期的差异具有统计学意义(P＜0.05),FOXO1蛋白表达水平与患者肿瘤分化程度、有无淋巴结转移、FIGO分期有关(P＜0.05).SOC组织KDM6B与FOXO1蛋白表达呈正相关(r=0.668,P＜0.05).KDM6B、FOXO1蛋白高表达者的总生存率和无进展生存率均显著低于低表达者(P＜0.05).结论:KDM6B、FOXO1蛋白在SOC组织中高表达,二者表达水平呈正相关,且KDM6B、FOXO1蛋白高表达者预后较低表达者更差,提示二者均可能在SOC发生发展中发挥促癌作用,且可作为影响SOC患者预后的关键因素,可能是潜在的SOC早期诊断和预后评估标志物.

目的:组蛋白修饰是表观遗传调控的一种重要形式.其中,组蛋白甲基化是染色质状态的关键决定因素.组蛋白H3第36位赖氨酸三甲基化产物(histone H3 trimethylation at lysine 36,H3K36me3)可以介导多种转录相关事件,有助于DNA损伤修复.组蛋白赖氨酸三甲基转移酶SET结构域2(SET domain containing 2,SETD2)、赖氨酸特异性去甲基化酶4B(lysine-specific demethylase 4B,KDM4B)分别是H3K36me3甲基转移酶及去甲基酶,SETD2失活及KDM4B活化均可下调H3K36me3水平从而促进肿瘤的发生和发展.本研究主要探讨H3K36me3、SETD2、KDM4B在结直肠癌中表达的临床病理意义.方法:收集2018年10月至2020年10月就诊于福建中医药大学附属人民医院的80例结直肠癌患者术后石蜡包埋的组织样本.采用免疫组织化学染色法检测H3K36me3、KDM4B、SETD2及4种错配修复(mismatch repair,MMR)蛋白质(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2)在结直肠癌及正常肠黏膜中的表达水平.采用多重荧光PCR-毛细管电泳检测结直肠癌及正常肠黏膜的微卫星状态,分为微卫星高度不稳定性(microsatellite instability-high,MSI-H)组与微卫星稳定(microsatellite stable,MSS)组,检测2组结直肠癌中H3K36me3及SETD2、KDM4B、MMR蛋白质表达情况并分析其临床病理意义.结果:STED2、H3K36me3表达与结直肠癌发生呈负相关(分别为r=-0.745,P<0.001;r=-0.160,P<0.05),KDM4B表达与结直肠癌发生呈正相关(r=0.660,P<0.001).不同的患者性别、年龄,不同的肿瘤发生部位、大体类型、肿瘤最大径、浸润深度、淋巴结转移的临床病理参数之间SETD2及H3K36me的表达差异均无统计学意义(均P>0.05),除在不同的肿瘤浸润深度KDM4B的表达差异有统计学意义(χ2=0.349,P<0.05)外,在其他临床病理参数上KDM4B的表达差异均无统计学意义(均P>0.05).结直肠癌样本中检测出14例为MSI-H结直肠癌、66例为MSS结直肠癌;SETD2及H3K36me3的表达均与结直肠癌微卫星状态相关(分别为χ2=3.916,P<0.05及χ2=41.608,P<0.001);KDM4B的表达与结直肠癌微卫星状态无明显相关性(χ2=0.067,P>0.05).SETD2及H3K36me3表达与MSI-H结直肠癌发生呈负相关(分别为r=-0.221,P<0.05及r=-0.721,P<0.001).KDM4B表达与MSS结直肠癌发生呈正相关(r=0.200,P<0.05).免疫组织化学染色结果显示13 例(16.25%)为dMMR,67例(83.75%)为pMMR;PCR-毛细管电泳验证结果显示14例为MSI-H结直肠癌,其中13例为dMMR,1例为pMMR;66例为MSS结直肠癌.免疫组织化学染色与多重荧光PCR-毛细管电泳检测结果具有强一致率(Kappa= 0.955).结论:H3K36me3及其表观遗传修饰蛋白质SETD2和KDM4B蛋白质的不同表达程度与结直肠癌发生、发展具有相关性.

目的 本研究旨在证实在神经母细胞瘤细胞(neuroblastoma,NB)中赖氨酸特异性去甲基化转移酶1 (1ysine specific demethylase 1,LSD1)促进β-联蛋白(β-catenin)在胞质中堆积,证实LSD1通过激活Wnt通路,从而引起NB细胞的增殖和转移,并探索其分子机制.方法 将对数生长期的293T细胞,接种在6孔培养板上,感染时细胞密度控制在60％～80％,每孔 2×106个细胞.分别配置溶液A:cDNA 10μl+ cDNA质粒转染培养基90μl;溶液B:空载质粒转染试剂5μl+ cDNA质粒转染培养基95 λl,混合溶液A和溶液B,室温放置30 min形成转染复合物,在含有细胞的无抗生素培养基中加入转染复合物使终体积为2 ml.Quantitative real-time PCR(qPCR)检测LSD1在NB细胞株SH-SY5Y细胞中的表达.LSD1慢病毒过表达载体的构建上调LSD1在NB中的表达.Western blot方法检测在SH-SY5Y细胞株调控LSD1表达后β-catenin的变化.免疫组织化学方法检测在SH-SY5Y细胞株调控LSD1表达后β-catenin的变化.结果 利用Western bolt方法检测人上皮细胞、大鼠神经元细胞、NB细胞中LSD1的表达量,人上皮细胞、大鼠神经元细胞、NB细胞三者的灰度值分别为133.87±10.54、135.00±12.48、192.00± 13.23,三组进行单因素方差分析无明显统计学意义(P＞0.05);建立LSD1稳转细胞株前后,SH-SY5Y细胞表达LSD1量有变化,通过qPCR对SH-SY5Y细胞株中的LSD1基因的相对量进行检测,LSD1表达抑制组的阈值循环数为22.003±0.320,转染空白质粒慢病毒载体的SH-SY5Y细胞组的阈值循环数为17.330±1.166,转染LSD1过表达慢病毒载体组的阈值循环数为13.216±0.137三组进行单因素方差分析,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 在神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞中,β-catenin随着LSD1的表达量的变化而变化,两者在SH-SY5Y细胞中的量呈正相关.

目的:探讨胰腺癌中E3泛素连接酶亚单位Ring1B、组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)及细胞周期调节因子P16表达与及其与患者预后的关系.方法:用免疫组化法检测85例胰腺癌患者手术标本(癌组织与癌旁组织)中LSD1、Ring1B与P16蛋白的表达及分布,并选取其中6对癌组织和癌旁组织,用qRT-PCR和Western blot法检测mRNA和蛋白表达;分析三者在胰腺癌组织中表达的相关性,及其与患者生存的关系.结果:免疫组化结果显示,Ring1B与LSD1蛋白主要表达于细胞浆,P16主要表达于胞核;Ring1B与LSD1在胰腺癌组织中表达明显高于癌旁组织,而P16的表达明显低于癌旁组织(均P＜0.05);在胰腺癌组织中Ring1B、LSD1的表达与P16的表达均呈负相关(r=-476;r=-0.673,均P＜0.05).qRT-PCR结果显示,胰腺癌组织中Ring 1B和LSD1的mRNA的平均相对表达量均明显高于癌旁组织(8.908vs.1.947;7.126 vs.1.940,均P＜0.05),P16的mRNA的平均相对表达量明显低于癌旁组织(1.269vs.5.237,P＜0.05);Western blot结果显示,三者的蛋白表达趋势与mRNA表达一致.生存分析显不,Ring1B、LSD1高表达患者生存率均分别低于其低表达患者(x 2=8.958,P=0.012;x 2=8.856,P=0.010),而P16高表达患者生存率高于其低表达患者(x 2=7.867,P=0.024).结论:胰腺癌组织中Ring 1B与LSD1表达升高,P16表达降低;Ring1B、LSD1可能分别通过组蛋白泛素化和去甲基化调控P16的表达,从而影响胰腺癌预后.

为了解miR167家族成员的分子特性及其可能互作的靶标在龙眼体胚发生早期的调控机制,采用生物信息学分析方法进行龙眼miR167基因家族序列分析、二级结构预测、分子进化树分析、靶基因预测及其靶标特异表达的FPKM值分析,并采用实时荧光定量PCR技术(quantitave real-time PCR,qPCR)检测miR167家族在体胚发生早期的转录水平.结果显示,龙眼miR167前体序列存在一个长为20 nt的重叠区域,miR167b的中间序列区域和3'端与此区域存在多个碱基差异;龙眼miR167前体成员均能形成茎环结构,且最小折叠自由能介于-79.95--46.90 Kal/mol之间;分子进化树显示龙眼miR167前体成员分别与番木瓜(Carica papaya)、番茄(Solanum lycopersicum)、高粱(Sorghum bicolor)和大豆(Glycine max)亲缘关系最近,miR167a、c、d、f在成熟体进化树中聚于同一支,靶标预测结果显示它们可能调控6个相同的靶基因,即E3泛素连接酶BIG BROTHER(BB)、AIRP2,MYB转录因子和生长素应答因子(ARF6、ARF8、ARF6-3),miR167b则单独分布于另一支中,并可能调控2个特异靶标,即赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)和细胞周期素(cyclin-C1-2-like);qPCR结果显示dlo-miR167a、c、d的表达均呈上调趋势,dlo-miR167d、f在3个阶段的表达水平较低;FPKM值显示ARF6/8、BB在体胚发生早期的表达模式与dlo-miR167a、c、d趋于一致,与AIRP2呈负相关.本研究表明在体胚发生早期ARF6/8和BB可能不受龙眼miR167的靶向调控,miR167可能通过靶向AIRP2参与早期体胚发生的形态建成,提示龙眼miR167基因功能的协同性和独立性并存.

目的:探究Wiskott-Aldrich综合征蛋白家族成员3(WASF3-AS1)对非小细胞肺癌(NSCLC)侵袭转移的影响及机制.方法:选取26例临床不同病理分期NSCLC患者的癌组织和癌旁组织,以及NSCLC细胞系NCI-H1975细胞和正常肺支气管上皮细胞系HBE细胞为研究对象.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测上述临床组织和细胞系中WASF3-AS1、赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)、组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)、E-钙黏蛋白(E-ca)、N-钙黏蛋白(N-ca)的表达.采用CCK-8实验检测细胞增殖.采用划痕实验检测细胞迁移能力.采用Transwell实验检测细胞侵袭能力.采用Western blot检测LSD1、HDAC6、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTEN)、蛋白激酶B(AKT)、E-ca和N-ca的表达.结果:与对照组比较,在NSCLC组织和细胞中,WASF3-AS1、LSD1、HDAC6、PTEN和E-ca低表达,AKT和N-ca高表达(均P<0.05);WASF3-AS1过表达能够促进LSD1和HDAC6并抑制PTEN/AKT信号,进而抑制NCI-H 1975细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间充质转化(均P<0.05).结论:ASF3-AS1可能通过招募LSD1和HDAC6到靶基因PTEN启动子区发挥抑制NSCLC细胞侵袭转移作用.

人类基因组计划表明,能编码的基因实际上仅占人类基因组的1. 5％,其余的绝大部分基因组属于非编码RNA( ncRNA) [1].ncRNA按长度进行分类,超过200 nt的称为长链非编码RNA( LncRNA) ,其余为短链 ncRNA.虽说是非编码序列,实际上LncRNA存在短的开放阅读框可以编码<100 个氨基酸长的小肽进行低表达[2].LncRNA本身也参与不同水平的基因表达,会影响染色质结构、表观遗传性、转录、RNA剪接、翻译等过程[3-5].大量研究证实,LncRNA参与肿瘤发生过程中细胞增殖的调控.例如, HOTAIR 是乳腺癌细胞生存所必需的LncRNA,主要在目标基因处募集多梳抑制复合物2 ( PRC2 )和赖氨酸特异性去甲基化酶1 这两种基因沉默因子,通过H3 K27甲基化和H3 K4去甲基化诱导基因沉默[6-7] ,CA3 在95％的前列腺癌患者中过度表达,从尿液中检测其表达可用于鉴别前列腺肿瘤的良恶性[8].MALAT1在原发性非小细胞肺癌中过度表达,在体外细胞实验中发现,其可通过分泌miR-200 a调节人肺腺癌A549细胞中ZEB1的表达,从而促进肺癌细胞的增殖和吉非替尼的耐药[9].PCGEM1的表达可通过抑制PARP裂解和延迟肿瘤抑制因子p53和p21 的诱导,抑制阿霉素诱导的细胞凋亡.在体外实验中发现,下调PCGEM1可通过结合miR-129-5 p及抑制ETV1 ,降低Hep3 B/OXA细胞对奥沙利铂的耐药性[10-11].GAS5 是一种抑癌基因LncRNA,其紊乱和基因突变与乳腺癌、前列腺癌、白血病、胃癌等密切相关[12].然而,关于LncRNA在癌症发生发展中的作用研究并不完整,关于其与新辅助化疗效果相关性的研究也很少.